意识形态学习计划8篇

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篇1

【关键词】 细胞株

Effect of Aminopeptidase Inhibitor on Differentiation Induction Activity of All-trans Retinoic Acid in Human Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells and Its Mechanism

Abstract

This study was purposed to investigate whether aminopeptidase inhibitor，bestatin，can potentiate all-trans retinoic acid (ATRA)-inducing differentiation in NB4 cells，and to explore its mechanism. The NB4 cells were exposed to either bestatin and ATRA alone or in combination，the morphological changes of NB4 cells were observed by optical microscopy，the CD11b expression was measured by flow cytometry，the function of defferentiation cells was analyzed by nitroblue-tetrazolium (NBT) reduction assay，the mRNA expressions of c-myc and c-EBPε in NB4 cells were detected by RT-PCR，the c-Myc protein expression was determined by Western blot. The results showed that treatment with bestatin alone induced no significant changes in morphology，NBT reduction activity and CD11b expression in NB4 cells. NB4 cells incubated with 10 nmol/L ATRA plus 100 μg/ml bestatin showed more morphologic feature of metamyelocyte and band neutrophil than ATRA alone treated cells. 100 μg/ml bestatin enhanced the NBT reduction activity in NB4 cells induced by various concentrations of ATRA (10，20，40 nmol/L). The effects of various concentrations of ATRA in combination with 100μg/ml bestatin were statistically different from the effect of ATRA alone (P

Key words bestatin; ATRA; cell line，NB4; differentiation

氨肽酶抑制剂乌苯美司（bestatin）能抑制氨肽酶N/CD13和亮氨酸氨基肽酶活性，通过增强宿主免疫功能及诱导肿瘤细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用［1，2］。有研究提示，bestatin能够诱导U937细胞的分化［1］，国内未见报道。我们以NB4细胞为研究对象，通过形态、功能和表面分化抗原等多层次实验研究，了解bestatin是否能诱导NB4细胞分化及（或）对ATRA的诱导分化作用的增强效应，并初步探讨其可能的机理。

材料和方法

主要试剂

Bestatin、ATRA均购于Sigma公司。bestatin以无菌去离子水溶解为1 mg/ml，分装之后-20℃保存；ATRA以无水乙醇溶解成10-5 mol/L的储存液，4℃避光保存，使用时用RPMI 1640细胞培养液将其稀释为相应工作浓度。NBT为BBI公司产品，以PBS配成0.1%溶液，过滤除菌后4℃避光保存，使用前1周内配制。RPMI 1640为Gibco公司产品。胎牛血清为JRH公司产品。CD11b-FITC标记单克隆抗体为Teotech公司产品。CD13-PE标记单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。TRIzoL试剂为Gibco公司产品，M-MLV逆转录酶和Taq DNA合成酶为Promega公司产品。鼠抗人c-Myc单克隆抗体（c-33）及羊抗人β-Actin多克隆抗体（I-19）均为Santa Cruz公司产品，使用时以TBST液分别按1∶500和1∶1 000稀释。ECL显色液为Santa Cruz公司产品。

细胞培养及药物处理

人APL细胞株NB4细胞（浙江大学肿瘤研究所惠赠）及人髓细胞白血病细胞株HL-60细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液中，置37℃、5% CO2培养箱中培养，2-3天传代1次。实验时取对数生长期的细胞，调整细胞密度为7×104/ml，以不同浓度ATRA和bestatin单独或联合处理，于不同时间收集细胞进行实验。

细胞形态学观察

取空白对照组及药物处理各组细胞悬液，离心，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，用光学显微镜（Leica，40×10）观察细胞形态。

四氮唑蓝（nitroblue-tetrazolium，NBT）还原实验

按文献［3］报道的方法进行。空白对照组及药物处理各组细胞与NBT共孵育后，制备涂片，瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下（100×10）观察，胞浆内含有蓝黑色颗粒者为阳性细胞，随机计数200个细胞，计算阳性细胞百分率。

细胞表面分化抗原CD11b和CD13的检测

取对数生长期HL-60细胞和NB4细胞或药物处理后各组NB4细胞离心，用PBS（pH 7.4）洗涤，调整细胞数为2×105/50 μl，加CD13-PE标记单克隆抗体8 μl或CD11b-FITC标记单克隆抗体5 μl，避光孵育30分钟，用PBS洗涤，上流式细胞仪检测。以Cellquest 1.2软件进行分析。

细胞总RNA提取和RT-PCR反应

总RNA提取 用TRIzoL一步法抽提细胞总RNA，按试剂说明书操作。甲醛变性凝胶电泳证实为完整RNA，紫外分光光度仪定量，A260 nm/280 nm比值均在1.8-2.0之间。

逆转录反应

样品总RNA 4 μg及随机引物0.5 μg，70℃ 5分钟，立即冰浴，离心。依次加5×逆转录酶缓冲液5 μl、10 mmol/L dNTP 1.25 μl、M-MLV 200 U，RNase抑制剂0.6 μl，DEPC水补至反应体积为25 μl，于27℃10分钟，37℃ 60分钟，72℃ 10分钟灭活逆转录酶，冰浴1分钟，结束反应。

PCR反应

PCR引物为上海Sangon公司合成。引物序列、反应条件及产物大小见表1。反应体系包括逆转录产物2 μl、10×PCR缓冲液2.5 μl、25 mmol/L MgCl2 1.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、25 μmol/L(c-myc与c-EBPε)或2.5 μmol/L(β-actin)上游及下游引物各0.5 μl、Taq DNA聚合酶1U，用灭菌去离子水补至终体积为25 μl。预实验确定产物与循环之间呈线性关系范围。取5 μl反应产物在15 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭）电泳，电场强度5 V/cm，紫外灯下观察电泳结果，用凝胶成像系统（BIO-RAD公司）扫描分析条带灰度，以目的基因与β-actin的灰度比做半定量分析。Table 1. Sequences of primers，condition of PCR and sizes of PCR products（略）

Western blot

收集药物处理各组细胞（细胞数为2×106/ml），预冷的PBS漂洗2次，重悬于100 μl Lammiulis上样缓冲液（0.125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，5%甘油）中，超声波裂解，于4℃离心13 000×g）15分钟，收集上清，蛋白样品保存于-80℃。按蛋白定量试剂盒（Bio-Rad公司）操作说明书进行蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜，转移后的硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉封闭1小时，分别与抗人c-Myc和抗人β-actin抗体及辣根过氧化酶标记的二抗孵育。ECL显色，显影于胶片。图像分析处理系统（Image Station 2000R）扫描，测定条带的面积和灰度，以二者之乘积进行半定量比较分析。

统计学分析处理

各项实验重复3次以上，以X±D表示，多组间比较F检验后采用方差分析及Tukey检验。相关分析采用Pearson相关。应用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。

结果

NB4细胞表面有CD13的表达

NB4细胞CD13阳性表达率为94.79%（平均荧光强度为1739.59），对照组HL-60细胞CD13阳性表达率为95.49%（平均荧光强度为3107.49）。两者的CD13平均荧光强度有一定的差异，但阳性百分率差异不明显。

Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞形态改变明显

100 μg/ml bestatin单独作用72小时后，NB4细胞形态无明显改变。10 nmol/L ATRA单独作用72小时后，NB4细胞呈现部分分化的形态，细胞核/浆比例减小，核变小有凹陷。100 μg/ml bestatin与10 nmol/L ATRA联合处理72小时后，NB4细胞形态分化更加明显，细胞浆内空泡增多，核凹陷、扭曲更加明显，形态似晚幼粒及杆状核粒细胞的细胞增多（图1）。

Bestatin与ATRA联合应用后NB4细胞NBT还原能力明显增加

以一定浓度（50、75和100 μg/ml）bestatin单独处理72小时后，NB4细胞的NBT还原能力无明显改变（与空白对照组相比较，P>0.05）；不同浓度（10、20和40 nmol/L）ATRA作用72小时后，NB4细胞的NBT还原能力呈浓度依赖性增加，与空白对照组相比，差异明显。100 μg/ml bestatin与不同浓度ATRA联合处理72小时后，NB4细胞的NBT阳性率明显地提高，与单用相应浓度ATRA组相比，差异显著（表2）。Table 2. Effect of bestatin on the NBT reduction activity of NB4 cells induced by ATRA. (略)

100 μg/ml bestatin单独处理细胞不同时间（48小时-96小时），NB4细胞的NBT还原能力改变不明显（与相应时间点空白对照组相比，P>0.05）；10 nmol/L ATRA处理细胞至72小时，开始出现NB4细胞NBT还原能力的增强，并呈时间依赖性，与相应时间点对照组相比，有明显差异；而10 nmol/L ATRA与100 μg/ml bestatin联合处理48小时，就出现NB4细胞NBT还原能力的明显增强，且此作用随时间延长而明显增强，与相应时间点单用10 nmol/L ATRA组相比，差异显著（图2）。

Bestatin与ATRA联合处理后NB4细胞CD11b表达明显增强

100 μg/ml bestatin单独处理72小时后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为13.4±0.6）稍有增加，但与对照组（MFI为12.3±0.9）相比，差异不显著（P>0.05）。10 nmol/L ATRA单独处理72小时之后，NB4细胞CD11b阳性表达率（MFI为19.2±4.2）明显提高，与对照组相比，差异显著（P

Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-EBPε mRNA表达的变化

NB4细胞低表达c-EBPε mRNA。10 nmol/L ATRA处理12小时之后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显提高，与对照组相比较，差异显著(P

Bestatin和ATRA单独及联合处理后NB4细胞c-myc表达的变化

NB4细胞c-myc mRNA呈高水平表达。10 nmol/L ATRA单独处理4小时后，NB4细胞c-myc mRNA表达下降，与空白对照组相比较，差异明显（P

Figure 4. Effect of bestatin and ATRA on the expression of c-myc mRNA of NB4 cells after treatment for 4 hours. M: marker; Lane 1: control. Lane 2: bestatin (100 μg/ml). Lane 3: ATRA (10 nmol/L). Lane 4: bestatin (100 μg/ml) +ATRA (10 nmol/L).

NB4细胞c-Myc蛋白呈高表达。10 nmol/L ATRA单独处理8小时后，NB4细胞c-Myc蛋白表达水平明显下降（P

讨 论

ATRA对APL的有效治疗是白血病诱导分化治疗的成功典范。但单用ATRA治疗易复发及产生耐药，与其他化疗药物联用时疗效有一定的提高，但毒副反应增加。因此，寻找能够增强ATRA诱导分化作用而毒副反应轻的药物，成为临床治疗中的关注问题之一［7，8］。最近，Hirano等［7］根据NBT还原实验结果提出，bestatin可能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用，但未做进一步的研究。本研究通过对细胞形态、功能和表面分化抗原等多层次的检测及分析对比，表明一定浓度范围的bestatin本身不能诱导NB4细胞分化，但确能增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用。

Hirano等［7］认为，bestatin增强ATRA诱导分化作用可能与其抑制细胞表面CD13活性有关。本研究结果显示，与HL-60细胞相似，NB4细胞表面CD13阳性表达率高达94.79%，该药是否通过抑制CD13表达从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用，尚待进一步研究证实。髓系祖细胞定向分化受转录因子活性的调节。ATRA调节与髓细胞定向分化有关转录因子的表达诱导APL细胞向中性粒细胞分化。氨基肽酶N/CD13为Ⅱ型跨膜蛋白，胞内端只有8-10个氨基酸，但最近研究报道，CD13分子能够直接参与细胞内信号转导的过程［9］。因此，本研究从药物对转录因子影响的角度对氨肽酶、抑制剂bestatin增强ATRA诱导分化作用的可能机制进行了初步探索。c-EBPε为C-EBP家族转录因子之一，ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞方向分化时，药物作用2小时，c-EBPε mRNA表达水平即开始增高，并持续增高至细胞终末分化［10］。而酪氨酸激酶抑制剂STI571增强ATRA诱导NB4细胞向中性粒细胞分化时，c-EBPε基因及蛋白的表达水平均未进一步增高［8］。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA处理12小时后，NB4细胞c-EBPε mRNA表达水平明显上升，而100 μg/ml bestatin与ATRA联合处理NB4细胞时，c-EBPε mRNA表达却未进一步增强。这提示bestatin可能与STI571相似，其增强ATRA对NB4细胞的诱导分化作用可能不是通过调节c-EBPε表达。

原癌基因c-myc表达异常与髓细胞性白血病的发生有关，抑制c-myc表达可以促使白血病细胞分化及诱导细胞终末分化后的凋亡。本研究结果显示，10 nmol/L ATRA单独作用能够使NB4细胞c-myc的表达下调，这与文献报道相似［11］。同时，bestatin与ATRA联合应用时c-myc表达水平的下调作用较单用ATRA时更加明显，且药物联合应用各组细胞的c-myc蛋白表达水平与药物诱导的NBT还原能力之间呈明显的负相关。这提示bestatin可能通过与ATRA协同下调c-myc表达，从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用。1，25-(OH)2 D3在诱导HL-60细胞分化时，激活蛋白激酶C，引起c-myc表达下调［12］。bestatin是否也通过激活蛋白激酶C增强ATRA下调c-myc的表达，这有待进一步研究证实。

【参考文献】

1Murata M，Kubota Y，Tanaka T，et al. Effect of ubenimex on the proliferation and differentiation of U937 human histiocytic lymphoma cells. Leukemia，1994; 8: 2188-2193

2林茂芳，何静松，蔡真等. 氨肽酶抑制剂Bestatin 通过激活半胱天冬酶3诱导HL-60细胞凋亡. 中华血液学杂志，2001; 22: 348-350

3韩锐. 抗癌药物研究与实验技术. 北京: 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997： 329-330

4Zhuang WJ，Fong CC，Cao J，et al. Involvement of NF-kappaB and c-myc signaling pathways in the apoptosis of HL-60 cells induced by alkaloids of Tripterygium hypoglaucum (levl.) Hutch. Phytomedicine，2004; 11: 295-302

5谭映霞，章圣辉，尹丽慧等. 三氧化二砷和全反式维甲酸联合用药诱导NB4细胞C／EBPε mRNA和CD11b表达的初步研究. 临床血液学杂志，2004; 17: 108-110

6林茂芳，俞静，严力行. 可溶性抗CD47单抗对人树突细胞分化与功能的影响. 中华血液学杂志，2004; 25: 709-712

7Hirano T，Kizaki M，Kato K，et al. Enhancement of sensitivity by bestatin of acute promyelocytic leukemia NB4 cells to all-trans retinoic acid. Leuk Res，2002; 26:1097-1103

8Gianni M，Kalac Y，Ponzanelli I，et al. Tyrosine kinase inhibitor STI571 potentiates the pharmacologic activity of retinoic acid in acute promyelocytic leukemia cells: effects on the degradation of RAR alpha and PML-RAR alpha. Blood，2001; 97: 3234-3243

9Santos AN，Langner J，Herrmann M，et al. Aminopeptidase N/CD13 is directly linked to signal transduction pathways in monocytes. Cell Immunol，2000; 201: 22-32

10Morosetti R，Park DJ，Chumakov AM，et al. A novel，myeloid transcription factor，C/EBP epsilon，is upregulated during granulocytic，but not monocytic，differentiation. Blood，1997; 90: 2591-2600

篇2

美国一项研究显示，打太极拳有助降低罹患帕金森病的几率。

帕金森病是一种脑部病变，造成中枢神经系统退化失调，导致患者走路、言语及其他活动受影响。医生大多建议患者多运动或进行物理治疗。

美国科学家最近针对约200名患有轻微或中度帕金森病的患者进行研究，给患者分组后，分别进行包括太极拳在内的不同运动。六个月后，研究人员发现，太极拳组的症状明显改善，效果比另外两组人好。研究人员表示，太极拳简单易学，又不需要特别装备，是一项值得推广的好运动。

照镜子越久越易焦虑

明镜可以正衣冠，但照镜太久，就会产生焦虑现象。英国精神医学研究机构日前发现，若照镜子的次数太过频繁，或每次照镜的时间超过10分钟的话，就会对自我形象开始产生焦虑，严重的话甚至会出现抑郁倾向。

根据《每日邮报》报道，研究人员找来25名患有身体畸形焦虑症（BDD）的病人，以及25名健康人士来进行对照实验，发现BDD患者对自己的相貌、身形缺憾有着不理性的焦虑，而照镜的时间越久，就越容易对自己的外貌感到不满。而健康人虽然刚开始自我观感良好，在10分钟过后，也开始产生自我不满、厌恶的感觉。

心理学家表示，通常人们照镜子不会花很多时间，也不会仔细分析自己的形象，一般只会留意自己满意的部分而已；但是BDD患者就因为太在意自己的形象，通常照镜子的时间更久，自我审查也比较严苛；就连健康人士，长时间对着镜子看，也会开始注意到身体不完美的地方，开始产生焦虑。

美学者称糖和酒精一样有害

近日，3名美国科学家称，糖和酒精一样有害，应该被控制食用。他们认为，糖对人类的危害不仅仅是会产生“空热量” (指含有高热量却缺乏基本维生素、矿物质和蛋白质)，导致人变胖这么简单。过去50年，全世界糖的消费量增长了两倍，导致患上肥胖症的人不断增多。含有高热量的甜食每年间接导致3 500万人死亡，这些人都死于与不良生活习惯有关的疾病，包括心脏病、糖尿病以及癌症。因此，他们呼吁，应该对糖的食用采取类似于针对酒精的限制控制措施。

科学家们指出，西方人对糖的食用量足以改变人的新陈代谢，使血压升高，扰乱荷尔蒙分泌，对肝脏造成严重损害。这种对人体健康的危害和过量饮酒的危害类似。

2011年286人因涉食品安全案获刑

严惩重处正成为食品安全治理的常态。根据国务院食品安全委员会的统一部署，各地区、各有关部门坚持重拳出击、重典治乱，大力开展食品安全综合治理和专项整治，严厉打击违法犯罪行为。

2011年，各级公安机关共侦破食品安全类犯罪案件5 200余起，抓获涉案人员7 000余人。各级检察机关共依法从快批捕制售有毒有害食品等犯罪嫌疑人1 801人，提起公诉1 254人。各级人民法院共审结生产、销售有毒、有害食品，生产、销售不符合卫生（安全）标准的食品等案件333件，刑事处罚416人（其中有286人被判处有期徒刑、无期徒刑和死刑缓期执行）。还有部分涉及危害食品安全的案件依法以生产、销售伪劣产品罪，以危险方法危害公共安全罪、非法经营罪等罪名从重处罚。各级食品安全监管部门坚持严格执法，强化日常监管，仅食品非法添加类案件就查处18 000多起，取缔关闭违法企业5 000余家。纪检、监察机关加大了对失职、渎职人员责任追究力度，因食品安全问题共对3 895人进行了责任追究。

人际关系不好可导致炎症恶化

一项发表于《美国科学院学刊》的研究报告指出，人际关系对身体健康的影响不容小视，特别是在心脏病、高血压、癌症的发病率上，其作用甚至不亚于饮食和休息。

美国加州大学洛杉矶分校医学院的科学家进行的这项新研究发现，人际关系处不好可能导致身体炎症恶化，进而引发一系列疾病，如心脏病、高血压、癌症等。研究人员通过对122名健康的年轻人进行跟踪观察研究，并根据他们的日记来判断其心情状态和周边人际关系后发现，保持积极向上的心态，使周围人能跟自己相处良好且没有竞争关系的状态，更容易让人保持身体健康，避免生病。

每天睡眠不足5小时易患糖尿病

日本研究人员发现，每天平均睡眠时间不足5小时的人，糖尿病发病风险骤增，是平均睡眠时间7小时以上者的5倍多。研究认为，充分的睡眠有助于预防糖尿病。

研究小组以3 570名公务员为对象，调查了其睡眠时间和睡眠满意度情况。这些人并非糖尿病患者，年龄在35岁至55岁之间。在随后的4年时间里，有121人患上糖尿病。分析发现，对父母和兄弟姐妹中没有糖尿病患者的人来说，睡眠时间不足5小时的人与超过7小时的人相比，其糖尿病风险约相当于后者的5.4倍；感到睡眠不足的人与没有这种感觉的人相比，其发病风险是后者的约6.8倍；半夜醒来后常常无法再睡着者，发病风险比没有这种情况的人高4倍。这些都显示，睡眠不足或质量不高的人，患糖尿病的风险非常高。

此前欧美的研究也显示，睡眠时间过短或过长，糖尿病的发病风险都会上升。在日本的这项调查中，每天平均睡眠时间不到5小时的人，很多是长时间工作或者轮班工作者。

21种假冒保健食品被曝光

近日，国家食品药品监督管理局官网曝光了21种假冒保健食品，绝大多数含有非法添加的化学药物。其中，减肥类假冒保健食品有13种，占到总数的62%。

食品药品监管部门在专项抽检中发现21种批次产品为假冒，并检出酚酞、西布曲明等化学药物成分。假冒产品的标示名称为7色瘦、福莱健牌褪黑素软胶囊、海兰鑫褪黑素软胶囊、御荣堂牌睡的好胶囊、央科牌美朵胶囊、纤纤减肥胶囊、天凤降脂胶囊(包装上为“苦瓜清脂素”)、天凤降脂胶囊(包装上为“脂肪燃烧弹天凤降脂灵胶囊”)、金葵花牌脂平喜胶囊、飒兰德牌健美颗粒、飒兰德牌健美颗粒(包装上标有左旋肉碱)、烛红牌百通美胶囊(白色)、草泽堂牌俏姿减肥胶囊、田顺牌活力胶囊、喜力来胶囊、佳信佰牌驰力片、数字牌减肥胶囊、数字牌减肥胶囊(包装上为Vc苹果醋瘦身胶囊)、艾邦牌艾参胶囊、仟佳丽牌减肥胶囊、仟佳丽牌减肥胶囊(包装上标有“左旋肉碱强效全身瘦”)。

低热量饮料增加患心脏病风险

近日，美国科学家公布的一项研究结果打破了低热量饮料在人们心中的美好形象。每天一罐低热量饮料不仅不能带来好身材，反而会大大增加罹患心脏病的几率。

专家们通过分析比对低热量饮料消费量与人们死于中风、心脏病和心脑血管疾病几率得出的结果显示，每天饮用低热量饮料的人群罹患以上疾病的几率比不饮用此类饮料的人群要高出43%。