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绪论：在寻找写作灵感吗？爱发表网为您精选了8篇生物细胞作用，愿这些内容能够启迪您的思维，激发您的创作热情，欢迎您的阅读与分享！
【关键词】 骨髓细胞；成骨细胞；生长物质；组织工程
0引言
骨骼损伤、肿瘤等导致的骨缺损是骨科每天都要面临的问题，临床医生通常是通过自体或异体骨移植方法来解决缺损问题，但这种方法存在着来源有限、增加创伤、排斥反应及疾病传播等问题. 由于利用组织工程学原理与方法再生的骨组织植入体内无免疫排斥的危险且来源充足，因此它的优势逐渐得到认同［1］ . 近年来，组织工程迅猛发展并且是目前公认的最有可能在临床取得实际效益的研究领域之一［2］. 但是要真正广泛应用于临床，还必须解决好组织工程的三大关键问题即种子细胞、可降解的生物支架及生长因子. 骨髓来源的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells， MSCs)由于取材容易，易于体外培养和诱导，是目前最有前途成为组织工程种子细胞来源的细胞［3-4］. 组织工程是将细胞与材料复合，从而构建植入人体的活材料. 在此过程中，目的细胞的生长调控是十分重要的一环，因此对生长因子的作用及其机制的研究是组织工程的重要内容. 生长因子是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子，它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移和基因表达的作用. 生长因子对目的细胞作用有利于在体外构建与体内更为相似的模拟环境，从而为体内试验奠定基础.
1骨髓基质干细胞及成骨诱导
目前，骨组织工程种子细胞的分离主要有三种来源：骨髓来源、骨膜来源和松质骨来源［5］. 种子细胞的培养是骨组织工程的前提与基础. MSCs 由于其强大的增殖能力与多向分化潜能成为骨组织工程的种子细胞之一［6］.
骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织，它除了是造血干细胞的主要来源外，同时成人的骨髓组织中还存在着骨髓间质干细胞. 20世纪70年代中期，Friedenstein等［7］报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落，这部分贴壁的细胞就是骨髓基质干细胞，也叫间质干细胞. 这种间质干细胞具有多方向的分化潜能，可以分化成为骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等组织［8-9］. 间质干细胞的多向分化特性使之成为组织工程的理想细胞来源，是目前骨组织工程普遍选用的细胞. 近年来的许多组织工程研究均采用了人或动物的骨髓间质干细胞，其结果十分令人满意［10-11］.
现有的MSCs培养方法主要为应用诱导剂 (地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸) 和生长因子进行诱导，但诱导效果均不甚理想. 国内外研究者发现， MSCs的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养MSCs，就倾向于向这类环境中的细胞分化. 根据MSCs分化的位点特异性，在骨组织工程中欲把MSCs诱导分化为成骨细胞，采用模拟成骨微环境来诱导MSCs的增殖与成骨分化可能也是一种有效的诱导方法［12-13］.
2骨组织工程相关因子
生长因子的合理应用对构建骨组织工程起着关键的作用. 骨组织拥有一个庞大的生长因子库，目前在骨组织中发现了十几种生长因子，已经发现有多种细胞因子对成骨过程具有重要的调节作用，可以诱导成骨、促进细胞增殖和胶原合成、促进成骨和血管生长以及在骨吸收改建方面发挥作用，因此在构建组织工程骨时对成骨因子合理使用或调控成骨细胞的适时适量表达十分重要.
2.1血管内皮生长因子VEGF又称血管通透因子(VPF)或（VAS），是近年来发现的一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对胚胎发育及切口修复等生理功能有重要意义. VEGF是一种糖蛋白，其相对分子量为34~45 ku由两个相对分子量各为17 ~22 ku的不同亚单位组成的二聚体，VEGF就是由于该基因的剪切方式不同所形成的系列产物. 人至少有4种VEGF，分别为VEGF121， VEGF165， VEGF189和VEGF206. 近年来研究表明，血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化. Midy等［14］发现，外源性VEGF能使体外培养的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP) 活性及cAMP浓度提高4倍. VEGF诱导成骨细胞迁移，增加ALP活性，同时成骨细胞自身合成VEGF. PGE1， PGE2， 1， 25(OH)维生素D3及IGFⅠ能增加成骨细胞VEGF mRNA的表达.
2.2肿瘤坏死因子TNF是一种糖蛋白的低聚物，分子量为39~70 ku，是多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生. TNF是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一. TNF分两大类：由活化的巨噬细胞产生的称为TNFα，由活化的T细胞产生的TNF称为TNFβ，它们共同作用于同一受体. TNF可刺激培养的成骨细胞和骨器官合成RNA和PGE2，TNF可以抑制胶原和骨钙素的合成以及1， 25(OH)维生素D3刺激的ALP活性，但它可刺激Ι型胶原mRNA表达，这说明TNF的这种胶原合成抑制作用受翻译后产物的调节［15］.
2.3骨形成蛋白BMP是广泛存在于骨基质中的一种酸性糖蛋白，是目前唯一被确认具有异位成骨能力的生长因子，它能在体内、外诱导骨髓基质细胞转化为成骨细胞，使高分化的骨细胞群体数量保持稳定. Okubo等［16］用支架材料与不同剂量的BMP复合后植入兔下颌骨的骨缺损中，3 wk后ALP和组织学检查发现新骨形成，证实BMP诱导成骨系软骨内化骨形成过程，且成骨量随BMP剂量增加而增加，有明显的剂量依赖性. 陈克明等［17］认为： BMP与纤维蛋白制成的复合物，具有良好的骨诱导活性. 载体包容BMP等诱导因子可有效缓慢的释放，以发挥其诱导作用. 余家阔等［18］认为，在BMP诱导下，无论是幼稚软骨细胞还是成熟软骨细胞都有表达成骨细胞表型的趋势. 目前认为BMP是骨组织工程中促进成骨作用最重要的一种，近年来BMP作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视，然而其诱导成骨的机制目前却并不完全清楚. 但由于BMP在骨组织中含量极少且在体内扩散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部发挥持续刺激和诱导成骨作用，其诱导活性难以得到充分的发挥［19］.
2.4转移生长因子TGFβ是一种有多种功能的单链多肽，分子量为25ku，具有对骨组织、结缔组织及免疫系统等细胞的调节功能，其调节作用包括细胞生长调节和分化诱导两方面. 目前发现有5种亚型，分别为TGFβ1~TGFβ5. TGFβ广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富，而TGFβ受体在成骨细胞表达最多，表明TGFβ的主要作用是调节骨代谢. 有实验表明TGFβ对胶原基因表达和胶原的合成具有促进作用. TGFβ可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌的调节因子［20］.
TGFβ为主要成骨因子之一，它诱导间充质细胞合成软骨特异性蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成. TGFβ在体外对成骨细胞的作用很复杂，部分取决于TGFβ的浓度、细胞密度、种系和成骨细胞的分化阶段. 多数研究认为TGFβ能抑制成骨细胞游离钙的合成、增加成骨细胞分化以及成骨细胞胶原和ALP的表达. TGFβ对成骨细胞生长有调控作用，这种作用在一定程度上表现为双相性. 研究表明，含血清培养的成骨细胞，低浓度的TGFβ可以刺激细胞DNA和胶原合成，抑制ALP活性，刺激细胞生长；而高浓度则抑制胶原合成，对DNA合成无作用. 无血清培养的成骨细胞，高浓度TGFβ抑制ALP生成. 此外，也有研究表明，TGFβ促进骨髓源性和骨膜源性骨前体细胞趋化到骨软骨损伤部位，进而增生、分化形成成骨细胞和软骨细胞 ［21］.
2.5成纤维细胞生长因子FGF是一种对中胚层和神经外胚层细胞具有促有丝分裂作用的多肽生长因子. 它对成骨细胞具有促增殖作用，并且通过增殖骨细胞数目促进骨形成. FGF分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因(bFGF)两种. aFGF存在于骨细胞浸出物中，bFGF存在于牛和人的骨骼中，前者较后者低10倍. FGF是毛细血管增殖刺激剂，能够促进毛细血管向断端内以及骨移植物中长入，使骨修复早期的组织中软骨岛数量增加，并使骨折断端骨痂血管重建的时间提前，而且可以增加BMP的成骨量. 目前虽然FGF的作用机制还不是很清楚，但是可以肯定的是局部和全身应用FGF可以促进骨形成. bFGF是一种内源性多肽生长因子，有试验表明它能有促进中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂的作用 ［22］.
2．6血小板源性生长因子PDGF 首先在血小板中发现，分子量为28～35 ku，由两个多肽键A和B组成异二聚体，在体外具有促进纤维细胞生长的作用，对所有起源于间叶细胞包括成骨细胞既能促进骨形成，又能刺激骨吸收，起双向调节作用［23］. PDGF还对中胚层细胞有促有丝分裂作用，它对人和鼠成骨细胞及其细胞系均有促有丝分裂作用. 同时它还是一个强力趋化因子，对人和鼠组织中的成骨细胞有强烈的趋化作用. PDGF 是由血小板、巨噬细胞和骨细胞合成，贮存于骨基质中. 它在创伤愈合中起重要作用，称为“创伤因子”. 其主要功能是诱导成骨细胞和骨祖细胞分裂，对于培养的成骨细胞有强烈的趋化作用，能刺激胶原合成. Canalis等［24］发现: PDGF有与IGFⅠ同样的作用，能刺激鼠骨DNA及胶原合成，但是PDGF也具有促使胶原降解的性能.
2．7类胰岛素生长因子IGF家族由两种相关多肽组成，即IGFⅠ和IGFⅡ. 它们是骨基质中最富含的生长因子，两者有相似的结构和体外作用，但在体内生物学效应不同. IGFI 在细胞增殖及细胞外基质合成代谢中具有重要作用. Throp等［25］研究证实了IGFⅠ和TGFβ具有相互作用以促进细胞增殖、胶原及蛋白聚糖合成的作用.
IGFⅡ是重要的细胞内调节剂，能刺激骨细胞的增生、增加骨细胞的分化和I型胶原合成. Strong等［26］发现IGFⅡ能在正常人骨细胞培养中24 h 内增加原胶原mRNA 2～4 倍.
综上所述，细胞因子不过是众多因子中研究较为成熟的几个，如何把这些因子的作用应用于组织工程中，才是我们研究生长因子的目的. 什么样的方法才能使细胞因子的活性在组织工程中发挥最好的作用还要进一步探讨.
参考文献
［1］EghbaliFatourechi G， Khosla S， Sanyal A， et al. Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausal women ［J］. J Clin Invest， 2003，111(8):1221-1230.
［2］裴国献，金丹. 骨组织工程研究进展［J］. 中华创伤骨科杂志，2004，6 (1) :38-42.
［3］CaplanAI.Review:mesenchymal stem cells: cellbased reconstructive therapy in orthopedics ［J］. Tissue Eng， 2005，11(728):1198.
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［4］Kan I， Melamed E， Offen D. Integral therapeutic potential of bone marrow mesenchymal stem cells［J］. Curr Drug Targets， 2005，6(1):31.
［5］Robey PG. Collagenasetreated trabecular bone fragments: a reproducible source of cells in the osteoblastic lineage［J ］. Calcif Tissue Int， 1995，6:S11-S12.
［6］Van Damme A ，VandenDriessche T， Collen D， et al. Bone marrow stromal cells as targets for gene therapy［J］. Curr Gene Ther， 2002， 2(2) : 195-209.
［7］Prockop DJ . Marrow stromal cell as stem cells fornonhematopoietic tissues［J］. Sience， 1997， 276:71-74.
［8］Haynesworth SE， Goshima J ， Goldberg VM， et al. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow［J］. Bone， 1992，13(1):81.
［9］Caplan AI. Mesenchymal stem cells［J］. J Orthop Res， 1991，9(5):641.
［10］Gao J， Dennis JE， Solchaga LA， et al. Tissueengineered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow derived mesenchymal stem cells［J］. Tissue Eng， 2001，7(4):363.
［11］Schaefer DJ， Klemt C， Zhang XH， et al. Tissue engineering with mesenchymal stem cells for cartilage and bone regeneration［J］. Chirurg， 2000，71(9):1001.
［12］殷晓雪，陈仲强，郭昭庆，等. 人骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞及其鉴定［J］. 中国修复重建外科杂志， 2004， 18(2): 88-91.
［13］Jendelova P， Herynek V， DeCroos J， et al. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles ［J］. Magn Reson Med， 2003， 50(4):767-776.
［14］Xi L， Tekin D， Bhargava P， et al. Whole body hyperthermia and preconditioning of the heart: basic concepts， complexity，and potential mechanisms ［J］. Int J Hyperthermia， 2001，17(5):439.
［15 ］Hughes S E， Hall P A. The fibroblast growth factor and receptor moltigene families ［J］. J Pathol， 1993，170(3)：219-21.
［16］Okubo Y， Bessho K， Fujimura K， et al. Osteogenesis by recombinant human bone morphogenetic protein2 at skeletal sites ［J］. Clin Orthop， 2000，375(3):295-301.
［17］陈克明，刘兴炎，葛宝丰，等. 纤维蛋白用作BMP载体的研究［J］. 中华骨科杂志，1998，18:234-235.
［18］余家阔，曲绵域，田得祥，等. 人骨形态发生蛋白对体外培养胎儿关节软骨块的影响［J］ . 中华外科杂志，1997，35 (11):687-689.
［19］Ebara S， Nakayama K. Mechanism for the action of bone morphogenetic proteins and regulation of their activity ［J］. Spine， 2002， 27:S10-S15.
［20］Wildemann B， Schmidmaier G， Brenner N， et al. Qantification， localization， and expression of IGFI and TGFbetal during growth factorstimulated fracture healing ［J］. Calcif Tissure Int， 2004，74(4):388-397.
［21］Yu Y， Yang JL， ChapmanSheath PJ， et al. TGFbeta， BMPS， and their signal transducing mediators， Smads， in rat fracture healing ［J］. J Biomed Mater Res， 2002，560(3):392-397.
［22］Nakamoto T， Inagawa H， Takagi K， et al . A new method of antitumor therapy with a high dose of TNF perfusion for unresectable liver tumor ［J］ . Anticancer Res， 2000，20 (6A) :4087.
［23］Horner A， Bord S， Kemp P， et al. Distribution of platederived growth factor ( PDGF) A chain mRNA， protein， and PDGFalpha receptor in rapidly forming human bone［J］. Bone， 1996，19(4):353-362.
［24］Canalis E， Mccarthy TL， Centrella M. Effects of plateletderived growth factor on bone formation in vitro［J］ . J Cell Physiol ，1989，140(3):530-537.
关键词：成纤维细胞 生物学特性 成骨作用
1 成纤维细胞的来源及其生物学特性
成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。
成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这
两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4，5］。
处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。
2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现
各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。
3 成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现
最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。
4 成纤维细胞的成骨作用
成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。
对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的
表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。
对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。
成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。
5 成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。
6 成纤维细胞在体外培养中的成骨作用
徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则
指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。
为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。
7 展望
尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。
参考文献
［1］温广明，徐达传.成骨细胞的成骨作用及复合移植研究进展.中国临床解剖学杂志，1999，17(4)：374
［2］徐荣辉，饶寒敏，朱雅萍，等.皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用.中华外科杂志，1994，32(3)：190
［3］饶寒敏，徐荣辉，朱雅萍，等.家兔皮肤成纤维细胞在体外培养中的成骨作用(显微录象与四环素标记观察).中华骨科杂志，1995，15(5)：295
［4］柴本甫，汤雪明.实验性骨折愈合的超微结构研究。中华外科杂志，1979，17：368
［5］裘世静，柴本甫.不同接骨板固定后骨折修复的超微结构研究.中华外科杂志，1990，28(2)：88
［6］Friedenstein a.Precursor cells of mechonocytes. In Rev Cytol， 1976，47(3):327
［7］Abdin m， Friedenstein AY. Electron microscopic study on bone induction by the transitional epithelium of the bladder in guinea pigs. Clin Orthop， 1972，82(2):182
［8］Brighton cT， Lorich DG， Kupcha R， et al. The pericyte as a possible osteoblast progenitor cell. Clin Orthop，1992，275(2)：287
［9］柴本甫，汤雪明.实验性骨折愈合的超微结构研究-成纤维细胞成骨作用的电子显微镜观察.中华实验外科杂志，1985，2(4)：157
［10］Chai bF， Zhu XL， Yang LF，et al. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅲ:electron microscopic observation on deposition of calcium salt crystals. Clin Med J，1979，92(10):668
［11］Tang xM， Chai BF. Ultrastructural investition of experimental fracture healing-Ⅳ：electron microscopic observation on transformation and fate of fibroblast and chondrocytes. Clin Med J，1981，94(5):291
［12］柴本甫，汤雪明，李 慧.实验性骨折愈合中钙化骨化的超微结构观察(兼论成纤维细胞的成骨作用).中华创伤杂志，1995，11(1)：4
［13］柴本甫，汤雪明，李 慧.骨折二期愈合过程中的成纤维细胞成骨作用.中华骨科杂志，1996，16(4)：245
［14］Mckibbin b. The biology of fracture healing in long bone. J Bome Joint surg(Br)，1978，60(1):150
［15］Sampath tK， Desimone DP， Reddi AH. Extracellular bone matrix-derived growth factor. Exp cell Res，1982，142(1):460
［16］马真胜，胡蕴玉，吕 荣，等.骨形态发生蛋白在闭合性长骨骨折愈合中的作用.中华实验外科杂志，1997，14(1)：50
［17］Onishi t， Ishidou Y， Nagamine T， et al. Distinct and overlapping patterns of localization of bone morphogenetic protein (BMP) family memebrs and a BMP typeⅡ receptor during fracture healing in rast. Bone， 1998，22(6):605
［18］司徒镇强，吴军正，主编.细胞培养.西安.世界图书出版公司，1996.7～12
［19］Friedenstein a. Induction of bone tissue by transitional epithelium. Clin Orthop， 1968，59:21
［20］邓廉夫，柴本甫，齐 进。损伤性和骨关节炎性滑膜细胞成骨作用的体外研究.中华骨科杂志，1997，17(11)：693
【关键词】 白杨素； 白血病； 增殖抑制
Anti-proliferation Effect of Phosphorylated Chrysin Derivatives in Leukemia Cells/FU Yun-bi，LIU Zhi-he，PENG Ai-yun.//Medical Innovation of China，2015，12（16）：120-123
【Abstract】 Objective：To investigate the anti-proliferation effect of a series new phosphorylated chrysin derivatives in leukemia cells.Method：The cell viability of the 12 phosphorylated chrysin derivatives in Kasumi-1 cells was detected by MTT assay，and the derivatives with higher proliferation inhibition rate than chrysin were selected out to process the next step to verify the anti-proliferation effect in K562 cells，HL60 cells，U937 cells，and bone marrow mononuclear cells （BMMNC） from acute leukemia patients.Result：Chrysin derivatives 3c and 7a could inhibit the proliferation of leukemia cells in vitro.Conclusion：The new phosphorylated chrysin derivatives 3c and 7a have potential value in anti-leukemia research.
【Key words】 Chrysin； Leukemia； Proliferation inhibition
First-author’s address：The 4th Hospital Affiliated to Medicine College of Ji’nan University，Guangzhou 510220，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.16.044
黄酮类化合物广泛存在于自然界的某些植物和浆果中，是药用植物中的主要活性成分之一，亦是人类饮食中的重要组成部分。黄酮类化合物以其广谱的药理作用尤其是抗肿瘤作用引人瞩目[1-3]。近年来世界上掀起了黄酮类化合物开发的热潮。白杨素（chrysin）是被广泛研究的黄酮类化合物之一，其来源于紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂胶中的含量较高，是蜂胶的主要有效成分。白杨素的化学名为5，7-二羟基黄酮。研究证明，白杨素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗高血压、抗糖尿病、抗菌、抗过敏等多种药理作用[4]。本研究旨在探讨新合成的一类膦（磷）酰化白杨素衍生物在体外对白血病细胞的增殖抑制作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料 Kasumi-1细胞株、K562细胞株、HL60细胞株、Jurkat细胞株、NB4细胞株及U937细胞株购中国科学院上海细胞库，白杨素含膦（磷）衍生物由中山大学化学与化学工程学院彭爱云提供。PRMI-1640培养基购自美国Gibco公司，新生牛血清从杭州四季青生物工程材料有限公司购买，甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司。
1.2 白杨素含膦（磷）衍生物的合成 以白杨素为先导化合物，按步骤1和步骤2所示的合成路线（图1），经膦（磷）酰化结构修饰后合成新的系列白杨素含膦（磷）衍生物。结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定。化合物合成由中山大学化学与化学工程学院合成。
1.3 细胞培养及原代细胞分离 细胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养基，加1×105 U/L青霉素、1×105 U/L链霉素，在37 ℃、95%饱和湿度和5% CO2条件下培养，1～2 d换液1次。
选取根据MIC分型诊断为急性白血病的初诊患者，抽取骨髓5 mL，分离单个核细胞（BMMNCs）。共分离10例急性白血病患者的BMMNCs。
1.4 MTT实验 取指数生长期细胞或BMMNCs，实验在96孔培养板中进行，每孔加入100 μL细胞悬液（2×104个细胞），100 μL用培养基稀释的药物。白杨素为阳性对照组、设溶媒对照组及调零组，每组3孔，培养一定时间后，实验组及对照组每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），调零组加入无血清PRMI-1640培养基，混匀，继续培养6 h，离心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶标仪以450 nm波长测定OD值，计算相对细胞活力，细胞活力（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%，重复3次实验。
图1 白杨素含膦（磷）衍生物的合成
1.5 统计学处理 使用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计量资料数据以（x±s）表示，采用t检验，P
2 结果
2.1 白杨素含膦（磷）衍生物的结构及理化性质 合成了12个白杨素膦酸单酯（3aC3l），6个白杨素膦酸（4aC4f），1个白杨素膦（磷）酸6和2个白杨素膦（磷）酸单酯7a，7b，共21个化合物。结构见图2。该类化合物是未见文献报道的新化合物，其构效关系显示有更强的抗肿瘤活性、较好的水溶性、更高的生物利用度，其结构经核磁、红外、质谱等确证，纯度经高效液相色谱鉴定，均达到99.5%以上，溶解度经高效液相色谱法测定为52.3-138.6 μm。
图2 白杨素含膦（磷）衍生物
2.2 白杨素含膦（磷）衍生物对Kasumi-1细胞增殖抑制活性筛选 为了筛选出增殖抑制活性较强的化合物，参照文献[5]报道先导化合物――白杨素抑制细胞活性的有效浓度，并以其作为阳性对照，12个化合物分别以100 μm作用细胞48 h，MTT试验检测细胞活性。结果见表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b对Kasumi-1细胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b对细胞的抑制活性远远高于先导化合物白杨素，比较差异有统计学意义（P
表1 白杨素膦（磷）酸衍生物对Kasumi-1细胞的增殖抑制率
化合物 增殖抑制率（%） 化合物 增殖抑制率（%）
3a 0.52±12.6 3l 3.19±13.43
3b -5.68±9.52 4a 16.40±13.17
3c 82.64±4.08 4b 36.09±6.48
3d 7.83±7.81 4c 9.25±17.13
3e 46.36±15.96 4d 1.74±6.39
3f 1.62±5.71 4e 0.08±8.64
3g 10.46±13.19 4f -6.99±13.36
3h 15.24±19.41 6 9.09±8.93
3i 16.42±7.95 7a 79.23±5.01
3j 42.89±7.93 7b 31.97±14.61
3k 8.07±14.65 Chrysin 47.39±6.03
以白杨素（chrysin）为对照，100 μm的3c、7a分别作用Kasumi-1细胞0、12、24、36、48、60 h，结果见图3。100 μm的3c作用36 h细胞活性最低，100 μm的7a作用48 h细胞活性最低。衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制活性呈时间依赖性，且均强于白杨素，比较差异有统计学意义（P
图3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞增殖抑制的时效关系曲线
2.3 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对多个白血病细胞株的增殖抑制活性 为了探讨衍生物3c、7a对其他白血病细胞株的活性，选用衍生物3c、7a对Kasumi-1细胞株有效作用时间及浓度，分别作用于Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株、HL60细胞株及U937细胞株，MTT法检测细胞活性。结果见图5、图6。衍生物3c、7a对以上细胞株的增殖均有明显的抑制作用，且呈时间及浓度依赖性。与对照组比较，作用时间48 h时，25 μm衍生物3c即对U937细胞产生明显的增殖抑制作用；50 μm浓度时对Jurkat细胞株、NB4细胞株、K562细胞株及HL60细胞株有明显的增殖抑制作用，差异具有统计学意义（P
2.4 白杨素含膦（磷）衍生物3c、7a对AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初诊的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急变1例，分离骨髓单个核细胞，用不同浓度的白杨素含膦（磷）衍生物3c或7a处理48 h，取10例患者各浓度的OD值平均数做曲线，结果见图7。与细胞株结果类似，衍生物3c及7a对急性白血病患者的骨髓原代细胞均有明显的增殖抑制作用，且为浓度依赖性。
3 讨论
许多研究者对从植物中筛选出的天然黄酮类化合物（如葛根总黄酮、姜黄素、金莲花黄酮、染料木黄酮等）进行了广泛研究，发现其在体内外对多种白血病细胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黄酮存在活性偏低、类药性差等缺点。为了提高其抗肿瘤活性，适应临床应用，各种各样的黄酮衍生物被合成[8-9]。文献报道最成熟的为国外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黄酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期临床试验已证实此药单用或与其他化疗药物合用对难治复发性急性或慢性白血病均有肯定疗效[6，10]。
图5 白杨素含膦（磷）衍生物3c对各细胞株的增殖抑制活性
注：A：0、25、50、75、100 μm的3c作用各细胞株48 h；B：100 μm的3c、作用各细胞株0、12、24、36、48、60 h
图6 白杨素含膦（磷）衍生物7a对各细胞株的增殖抑制活性
注：A：0、25、50、75、100 μ的7a作用各细胞株48 h；B：100 μm的7a、作用各个细胞株0、12、24、36、48、60 h
近年来许多国内外学者对白杨素衍生物的合成方法和生理活性进行了研究，对白杨素进行硝化、烷基化、羟甲基化、氟甲基化、膦（磷）酰化后合成的部分衍生物具有较强的抗肿瘤活性，在体外对许多肿瘤细胞都有明显的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 细胞、人肺癌A549 细胞、人肝癌HepG2细胞及HepB3细胞、人宫颈癌HeLa细胞、人鼻咽癌CNE-2细胞、人结肠癌（HT-29）细胞、人类小细胞肺癌NCI2H446细胞、人急性粒细胞性白血病HL-60细胞、人急性T淋巴细胞白血病Jurkat 细胞、急性白血病（M5）U937细胞等[5，11-13]。白杨素膦（磷）酰化结构修饰的报道较少，陈晓岚等[14]对白杨素进行了含膦（磷）改造，共合成出4种新的化合物，他们的研究结果表明，白杨素含膦（磷）衍生物与溶菌酶具有更强的亲和力。张婷等[15]合成了白杨素四乙基二膦（磷）酸酯，并发现白杨素和白杨素四乙基二膦（磷）酸酯对宫颈癌Hela细胞软琼脂的集落形成有明显抑制作用，能诱导并促进宫颈癌Hela细胞发生分化，且白杨素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面较白杨素明显，该研究提示膦（磷）酸基团的添加增强了抗肿瘤活性。
笔者通过化学法，将膦酸或膦（磷）酸基团引入到白杨素侧链中，新合成21个未见文献报道的白杨素含膦（磷）衍生物。这些白杨素含膦（磷）衍生物具备以下优点：（1）它们较白杨素具有更好的水溶性。预期在体内能较好的被吸收，可以弥补大多数天然黄酮因水溶性较差而导致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基团是一些抗骨质疏松、抗病毒、抗肿瘤等药物分子的药效团，白杨素又具有广泛生物活性，所合成的白杨素含膦（磷）衍生物应用了药效团拼合原理，可能具有更好的药理活性。通过体外细胞增殖抑制试验，从新合成的白杨素含膦（磷）衍生物中筛选出对急性白血病（M2）细胞株Kasumi-1增殖抑制作用较强的2个衍生物（3c、7a），这两个化合物100 μm浓度作用48 h对白血病细胞的增殖抑制率分别为82.64%、79.23%，白杨素同等条件下对白血病细胞的抑制率为47.39%。此后，用衍生物3c及7a分别处理多个细胞株及急性白血病患者的骨髓原代细胞，发现，白杨素含膦（磷）衍生物3c及7a对检测的多个白血病细胞株及患者骨髓原代细胞均有明显的增值抑制作用，说明该两个衍生物有体外抗白血病活性，有进一步进行体内抗肿瘤活性研究的价值。
参考文献
[1] Karp J E，Garrett-Mayer E，Estey E H，et al.Randomized phase Ⅱ study of two schedules of flavopiridol given as timed sequential therapy with cytosine arabinoside and mitoxantrone for adults with newly diagnosed，poor-risk acute myelogenous leukemia[J].Haematologica，2012，97（11）：1736-1742.
[2] Bose P，Perkins E B，Honeycut C，et al.Phase Ⅰ trial of the combination of flavopiridol and imatinib mesylate in patients with Bcr-Abl+ hematological malignancies[J].Cancer Chemother Pharmacol，2012，69（6）：1657-1667.
目的 探讨莱菔子水溶性生物碱对ApoE基因敲除小鼠内皮细胞抗氧化保护作用。方法 将50只ApoE基因敲除小鼠随机分为5组：模型组、莱菔子水溶性生物碱高、中、低剂量组、血脂康组，每组10只；另取10只C57BL/6J作为空白组。8 w后，眼球取血处死，随机选取6个样本检测指标。结果 与模型组相比，莱菔子各剂量组均能明显提高ApoE基因敲除小鼠血清NO含量(P＜0.05)；提高血清SOD的活性（P＜0.05）；降低血清MDA（P＜0.01）含量。结论 莱菔子水溶性生物碱通过提高ApoE基因敲除小鼠血清NO含量、提高SOD活性、降低MDA含量，发挥抗氧化作用，从而保护内皮细胞。
【关键词】 莱菔子水溶性生物碱；ApoE基因敲除小鼠；抗氧化
莱菔子是十字花科植物萝卜(Raphanus sativus L.)的干燥成熟种子，在《日华子本草》中记为萝卜子。其性味辛、甘、平，归肺、脾、胃经，主要功效为降气化痰，消食除胀。《本草纲目》记载：“莱菔子长于利气”。莱菔子水溶性生物碱以芥子碱(Sinapine)为主要成分，广泛存在于十字花科植物中的一种季胺盐物质。本实验通过观察莱菔子水溶性生物碱对载脂蛋白E（ApoE）基因敲除小鼠血清一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)影响来探讨莱菔子水溶性生物碱抗动脉粥样硬化（AS）作用的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品制备
莱菔子水溶性生物碱，由吉林省中医中药研究院新药中心制备。
1.1.2 实验动物
北京维通利华公司提供雄性ApoE基因敲除小鼠75只，雄性C57BL/6J小鼠15只，13周龄，体重（22±2）g，清洁级。
1.1.3 主要仪器及试剂
电子记重秤AWH（SI）-2.5 kg：国产；BD/BC518 -20℃冰箱：国产；4℃冰箱：国产；Q/IFGM0182000低温高速离心机：德国；HH·W21·600电热恒温水浴箱，小型台式离心机：上海医疗器械厂；PERLONG；pus2018 半自动生化分析仪：北京普朗新技术有限公司。
1.1.4 基础饲料
玉米粉26.0％，面粉29.0％，豆粕28.0％，磷酸氢钙1.4％，石粉1.6％，鱼粉5.0％，骨粉5.0％，盐1.0％，多种维生素1.5％，多种微量元素1.5％。
1.1.5 肥甘饲料
由10.0%猪油，2.0%胆固醇，20.0％蔗糖，5.0%蛋黄粉，0.2%胆盐，0.2%甲基硫氧嘧啶，62.6%基础饲料配制而成。
1.2 方法
1.2.1 分组及给药
将ApoE基因敲除小鼠（高脂饮食）随机分为5组，每组15只。模型组，每日灌服饮用水；莱菔子水溶性生物碱高剂量组90 mg·kg-1·d-1，莱中剂量组60 mg·kg-1·d-1，低剂量组30 mg·kg-1·d-1(分别相当于生药60、40、20 g/kg)，血脂康组0.2 g·kg-1·d-1，另取10只C57BL/6J大鼠作为空白对照组。空白对照组及模型组给等体积蒸馏水灌胃。给药时间为8 w。
1.2.2 样本的采集及检测
给药8 w后，于末次给药后摘眼球取血处死动物。分离血清后，随机选取6个样本进行检测。NO试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.3 统计学方法
运用SPSS13.0软件进行计算，实验数据均采用x±s表示，组间比较采用方差分析。
2 结果
治疗8 w后，各组小鼠血清NO、SOD及MDA变化比较，见表1。表1 各组治疗8 w后各项指标变化比较(略)
3 讨论
在AS的发生发展过程中伴随着机体氧化应激反应增强，氧自由基(OFR)产生增加，而机体具有抗氧化能力的SOD、谷胱苷肽过氧化物酶（GPX）活性及NO含量等明显降低，即抗氧化酶系的保护作用减低。OFR对血管内皮恭能的影响主要表现在〔1〕：①损伤内皮依赖的血管扩张。由于O-2灭活NO、GPX缺失等造成血管内皮功能障碍。②诱导内皮细胞凋亡。内皮损伤或暴露于O-2和H2O2诱导的细胞凋亡，以致AS发生和促凝血状态。③诱导内皮细胞黏附分子表达。④血管新生。除了对胚胎发育和创伤修复发挥生理作用外；在病理方面其可参与内皮细胞迁移、增殖和血管形成；此外，还参与血管VSMC的生长，迁移。
NO能够与脂氧化自由基直接反应而干扰低密度脂蛋白（LDL）的氧化过程，从而阻止氧化LDL（oxLDL）的生成及对内皮细胞的破坏。SOD是一种广泛存在生物体内的金属酶类。以O2为底物，是清除超氧离子自由基的特效酶类。脂质氧化应激的产物为MDA。本实验结果表明，各治疗组均能增加小鼠血清NO含量；提高血清SOD活性，降低MDA的含量，其调节作用随着剂量的增加而增强，呈剂量依赖性。莱菔子高剂量组
与血脂康组比较无显著差异。
NO是一种理想的抗AS因子，提高NO浓度可以改善血管内皮功能〔2〕。SOD又是清除氧自由基的专一酶，因此，莱菔子水溶性生物碱可能通过这一机制而发挥抗氧化和保护内皮细胞的作用。
参考文献
【关键词】 乳腺癌； 金雀异黄素； 衍生物； 细胞周期
中图分类号 R737.9 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2013）36-0147-02
金雀异黄素（genistein，GEN）是在大豆中天然存在的异黄酮类物质。研究表明，GEN是一种强力的酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶抑制剂，能通过多种途径在体外显著抑制多种细胞的生长[1]。但由于其在体内很难达到有效的血药浓度，因而限制其体内的抗肿瘤作用的发挥[2]。为增加GEN体内的生物学活性，研究者们试图对金雀异黄素进行结构改造[3]，以期提高其体内抗肿瘤作用。本实验旨在前期对GEN进行结构改造研究基础上进一步研究GEN衍生物dFMGEN体内外抗乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
金雀异黄素衍生物dFMGEN合成方法详见参考文献[4]。金雀异黄素、二甲基亚砜（DMSO）、MTT为Sigma公司产品；PRMI-1640培养基等细胞培养用试剂为Gibco公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞与细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。细胞培养于含10%小牛血清（FCS），1×105 U/L链霉素及1×105 U/L青霉素的RPMI-1640培养基中常规培养传代，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT实验检测dFMGEN对细胞增殖的影响 按1.5×104/孔的密度接MCF-7细胞种于96孔板，待细胞贴壁后加入20 μl不同浓度dFMGEN，使其终浓度分别为5、10、20、40 μM，GEN对照组为40 μM的GEN，GEN对照组加入相同体积含终浓度为0.1% DMSO的完全培养基，每组设6个复孔，分别处理24 h或48 h。在培养结束前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μl，显示后用酶标仪（EX-800型）在570 nm波长测吸光值（A值）。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期及凋亡 收集经不同药物处理的dFMGEN细胞，冷PBS洗2遍，用4 ℃的70%乙醇固定24 h后，经碘化丙啶（PI）染色，用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。
1.2.4 裸鼠异种移植瘤治疗实验 取雌性Balb/c-nu小鼠20只，4周龄，体重约9～11 g，调整MCF-7细胞浓度为3×107/ml，按
0.2 ml/只接种于小鼠背部皮下，出现移植瘤后按公式V=W2（短径）×L（长径）×0.52计算瘤体积，待移植瘤体积达100 mm3左右时随机分为5组，即对照组（含0.1% DMSO的PBS）；GEN对照组（GEN 45 mg/kg）；低、中、高剂量dFMGEN组（dFMGEN 5、15、45 mg/kg）。各组均隔日经腹腔注射给药1次，共计10次，末次给药48 h后脱臼处死小鼠，称取瘤及肝脾重量。
1.3 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行One-way ANOVA检验及t检验，P
2 结果
2.1 dFMGEN对体外培养的MCF-7细胞增殖的影响
采用MTT法检测不同浓度dFMGEN或GEN对MCF-7细胞生长的影响，dFMGEN能呈时间-剂量依赖性抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖，且作用强于母体化合物GEN的GEN对照组（P
2.2 dFMGEN和Genistein对MCF-7细胞周期及凋亡的影响
流式细胞术检测结果提示，10、40 μM的dFMGEN作用于MCF-7细胞48 h后，其G1期细胞分别为65.6%和81.6%，较空白对照组和40 μM Gen处理组的51.5%和63.4%有明显提高（P
2.3 dFMGEN对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠异种移植瘤生长的影响
治疗模型发现实验组裸鼠体重、肝脾重量与对照组比较，dFMGEN对瘤生长大小的影响呈现出明显的剂量依赖性，dFMGEN体内抗瘤作用明显强于GEN对照组（P
3 讨论
本研究中，笔者将二氟亚甲基导入GEN后，其抗肿瘤作用明显增强（P
由于体内的生长环境较复杂，药物需通过肠系膜的吸收及肝脏的代谢等才能发挥抗肿瘤作用，这也就导致了一些药物体内外研究结果不一致[7]。如实验表明，尽管GEN在体外可抑制乳腺癌细胞的生长，但是对裸鼠的乳腺癌细胞异种移植瘤却并不能获得相同的效果，与此相反，由于它在体内的吸收效果较差，不能达到体外抑制时的浓度，使得GEN在低浓度时所具有的雌激素样作用得到发挥而刺激肿瘤的生长[6]。因此，在本实验中为了进一步评价dFMGEN的体内抗肿瘤效果，笔者成功地建立了人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠异种移植瘤模型并对其通过腹腔注射给药进行体内治疗试验，结果发现高剂量dFMGEN处理后在体内对肿瘤的抑制率为81.6%，而相同剂量的GEN体内抑制率仅为56.4%。其原因可能是将含氟基团引入GEN后，能极大的改善其理化性质和生物学活性[8]，而且C-F键能大大增加化合物的亲脂性，使含氟化合物能够更易透过组织细胞膜，从而提高含氟化合物在生物体内的吸收和转运，进而发挥更强的体内抗肿瘤作用[9]。总之，本研究结果为开发新的、具有应用前景的抗乳腺癌新药提供了理论依据。
参考文献
[1]许银燕，管静.Genistein的生物学功能研究进展[J].医学综述，2010，16（5）：753.
[2]Santell R C，Kieu N，Helferich W G.Genistein inhibits growth of estrogen-independent human breast cancer cells in culture but not in athymic mice[J].The Journal of nutrition，2000，130（7）：1665-1669.
[3]芦金荣，邢辉，龙文艳，等.具有肿瘤多药耐药逆转作用的金雀异黄素衍生物的合成及生物活性研究[J].有机化学，2011，31（11）：1884-1892.
[4]Peng B，Cao J，Yi S，et al.Inhibition of proliferation and induction of G1-phase cell-cycle arrest by dFMGEN， a novel genistein derivative， in lung carcinoma A549 cells[J].Drug and Chemical Toxicology，2013，36（2）： 196-204.
[5]Du M，Yang X，Hartman J A，et al.Low-dose dietary genistein negates the therapeutic effect of tamoxifen in athymic nude mice[J].Carcinogenesis， 2012，33（4）：895-901.
[6]Bible K C，Kaufmann S H.Flavopiridol：a cytotoxic flavone that induces cell death in noncycling A549 human lung carcinoma cells[J].Cancerresearch，1996，56（21）：4856-4861.
[7]任虹，田文静，张瑞，等.源于果蔬的黄酮类化合物及其抗肿瘤作用靶点研究进展[J].食品科学，2013，34（11）：321-326.
[8]王一敏，薛伟.氟化反应在药物合成中的应用[J].中国医药指南，2013， 11（13）：463-465.
【摘要】
目的： 研究不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法： 采用共沉淀法制备得到不同粒径FeOx，将不同粒径FeOx吸附于细胞表面，并加载静磁场(SMF)及100 Hz交变磁场(EMF)照射。运用CCK8检测纳米粒子吸附后在外加磁场作用下Bel7402细胞增殖情况，运用流式细胞仪检测细胞凋亡、死亡率及细胞周期变化。结果： 不同粒径磁性纳米FeOx在SMF照射时间低于72 h时能使Bel7402细胞增殖速度增快，当照射时间大于72 h时，细胞增殖速度未发生明显变化但部分细胞发生凋亡，凋亡率为(3.1±0.78)％。而经EMF照射后37 nm FeOx吸附细胞增殖被抑制，细胞周期实验结果表明大部分细胞被阻滞在G0/G1期，细胞出现大量死亡与凋亡，凋亡率达到(23.34±3.6)％、死亡率达到(57.24±2.7)％。结论： 纳米粒子未有外加磁场照射时不能对细胞产生明显的影响，外加SMF照射时，细胞的增殖及DNA代谢未发生明显的变化，但细胞发生凋亡；外加EMF照射时，细胞增殖被抑制并发生明显的凋亡及死亡，细胞DNA代谢明显紊乱，且具有较小粒径的磁性纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞影响最为显著。
【关键词】 磁性纳米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期
［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.
［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle
磁性纳米材料具有良好的磁导向性、较好的生物相容性、生物降解性和活性能基团等特点［1-3］，它可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。磁性纳米材料特别是Fe属纳米颗粒已经被广泛应用于药物靶向治疗及干细胞定向移植治疗中［4］。当粒径在30～200 nm之间时，矫顽力和饱和磁化强度均达到最大值，且具有单畴特性。目前已有纳米磁性氧化铁等颗粒作为药物或干细胞载体用于肝癌动物实验的研究，但对磁性纳米氧化铁粒子本体对人体研究相对较少［5］。本研究以肝癌细胞Bel7402为对象，观察不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对其生物学特性的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 试剂及仪器
肝癌细胞株Bel7402购自中国科学院上海细胞库。静磁场发生仪为两块强磁场稀有金属镍/铁永磁体，当两块磁体间距为2.5 cm时其场强为0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉计/高斯计为上海亨通磁电科技有限公司产品。变频仪(FT1000型)为南京万臣电子有限公司产品，变压器(PT800型)为上海富济电子公司产品。胰蛋白酶、Primilar1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，维生素C、青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品。CCK8试剂盒为美国ADL公司产品，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国BD公司。FeSO4、醋酸锌均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。扫描电镜(SEM)型号为HITACHIX650，X射线衍射仪(XRD)型号为Philips X′pert XRD system型。
1.2 方法
1.2.1 磁性纳米FeOx的制备
运用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸锌为反应物，反应在乙醇、水（1∶3）混合溶剂中进行并加入质量百分比为2％的甘油，制备得到醋酸亚铁前驱体，前驱体粉末灼烧温度为400℃，灼烧4 h后得到FeOx粉体，10 000 r/min离心30 min，得到上下两层不同粒径粉末，经SEM及XRD实验确定其粒径及成分组成。SEM实验前样品用超声清洗仪超声分散10 min。XRD实验条件为：扫描速率为2θ/min，测定纳米粉体XRD谱。
1.2.2 磁性纳米FeOx吸附细胞实验
将不同粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于105个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30 min，摇床摇速为200 r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2 d后经SEM实验确定磁性纳米FeOx结合效率。
1.2.3 细胞培养
细胞种植到含10％FBS PIMIRIER 1640培养基的培养瓶，放置在37℃，5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1 500 r/min 15 min离心洗涤2次，用含10％FBS 1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存浓度应高于106个/ml。
1.2.4 磁场照射细胞方法
静磁场(SMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于两块永磁体之中，同时置于细胞培养箱中培养，每间隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交变磁场(EMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2 cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67 mT，每间隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。
1.2.5 CCK8细胞增殖实验
按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50 μl的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50 μl细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100 μl的酶标记液，36℃孵育1 h，将溶液倾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反应15 min后加入终止液50 μl，终止反应。测定450 nm的光密度值。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。
1.2.6 细胞凋亡、死亡及周期实验
细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次并将细胞浓度重悬调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液，然后用AnnexinV加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A，B，C，D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15 min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。
1.2.7 统计分析
实验结果用±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。
2 结果
2.1 纳米FeOx表征实验结果
SEM及XRD实验结果表明两种粒子的平均粒径分别为37，70 nm左右，粒子形状为不规则球形（图1，2）。根据Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D为粒子粒径，K为形状因子，λ为X 衍射的波长，β为衍射峰的半峰宽，θ为衍射角。经XRD实验结果证明粒子中Fe，O两种元素的比例为1∶1.12。图3为2种FeOx与Bel7402细胞吸附情况，图中FeOx为黑色颗粒，FeOx与Bel7402细胞发生了较为明显的吸附，37 nm粒子更易于在细胞表面吸附，表现为每个细胞表面吸附粒子数量明显增加。
(a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)
2.2 细胞增殖实验结果
不同粒径纳米FeOx在未经磁场照射时并未对细胞增殖产生明显的影响，细胞经SMF照射其增殖在磁场照射初期速度变快，当照射时间超过72 h后增殖未发生明显改变(相对对照组)。 经EMF照射后两种粒子吸附细胞的增殖均被抑制，当EMF照射时间为5 h时细胞增殖抑制率达到最大，37nm FeOx抑制率达到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率为（53.56±5.2）％。
2.3 细胞凋亡及死亡实验结果
从表1可见，凋亡率、死亡率3组间比较差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞死亡及凋亡。表2可见37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射达到60 h后，细胞发生凋亡，当照射时间为72 h时37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率仅为（1.25±0.23）％。而未经磁场照射37nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.02±0.04）％，未经FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。
表3表明随着EMF照射时间的延长，细胞凋亡率随之增加，当照射时间达到5 h时其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（12.54±6.7）％，死亡率为（37.28±4.2）％。当照射时间超过5 h后，细胞凋亡率增速变慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）
2.4 细胞周期实验结果
从表4可见，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长细胞周期，与未经处理Bel7402细胞作比较，无统计学意义，与凋亡实验结果相符，表明FeOx吸附细胞并不能影响细胞周期代谢。表5表明当细胞被纳米粒子吸附并在外加SMF照射下细胞DNA代谢未发生紊乱，在SMF照射初期细胞处于S，G1期细胞比例增加，细胞增殖变快，与细胞增殖实验结果吻合，当照射时间超过72 h后细胞处于G0期含量增加，细胞进入增殖静止期。凋亡实验结果表明此时细胞发生明显的凋亡，表明细胞凋亡通路被激活，细胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然增殖细胞周期实验结果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞周期实验结果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。
表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞在外加EMF作用下，细胞DNA代谢均发生明显变化，细胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h时37 nm粒子吸附细胞值为（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附细胞值为（63.5±2.4）％，细胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射细胞周期实验结果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。
3 讨论
磁性纳米材料已经被用作药物或干细胞的载体用于各种疾病的靶向治疗［6］，但现有研究多集中于纳米粒子与药物或干细胞的吸附研究，对磁性纳米粒子本体在外加磁场作用下对细胞或生物体影响的研究较少，本研究即以磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞Bel7402的影响为研究对象。
我们采用共沉淀法制备得到的纳米FeOx粒子的平均粒径分别为37 nm及70 nm且粒径分布均匀。粒子形状为不规则球形，XRD实验结果表明粒子的表面有较多的空间位隙，导致粒子中两种元素的化学计量比不规则，其Fe与O计量比为1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的纳米粒子更容易吸附小分子物质或更容易吸附在其他物质表面［7］，本文合成得到的纳米粒子具有较多的晶格缺陷，实验用纳米FeOx较易在细胞表面发生吸附。
细胞增殖实验表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在细胞表面后在SMF照射条件下，细胞增殖速度在照射初始阶段增加，当照射时间超过72 h后细胞发生凋亡，但增殖速度未发现明显变化，可能由于FeOx吸附细胞后在SMF照射条件下更易沉降到细胞培养瓶底部。纳米FeOx并不能影响细胞的正常分裂与增殖，同时SMF照射细胞也不能引起细胞发生改变，与文献报道结果类似［8］。EMF照射细胞能抑制细胞增殖，细胞增殖时间明显延长，当EMF照射时间达到5 h后，EMF照射FeOx吸附细胞抑制达到最大。比较两种FeOx吸附细胞在EMF照射条件下细胞增殖结果可以得出，37 nm FeOx粒子对细胞的增殖抑制更为显著，表明纳米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌细胞的增殖。
EMF照射细胞本身能影响细胞的增殖，导致细胞早期凋亡以及细胞DNA代谢发生紊乱和DNA双链断裂［9］。本研究表明，纳米粒子吸附到细胞表面后在外加EMF作用条件下这种影响更为明显，具有更小粒径的FeOx在EMF作用下对细胞凋亡的影响更为显著。同时，随着EMF照射时间增加，FeOx吸附的细胞DNA代谢发生紊乱，大部分细胞被阻滞在G0/G1期，同时处于S期的细胞含量减少，表现为明显的S期和G2 期阻滞。
纳米粒子在吸附到细胞表面后可一定限度地改变细胞表面电势，EMF同样能改变细胞表面的电势而导致细胞发生凋亡等生理现象［9，10］。两种外加因素对细胞的影响有明显的叠加效果，纳米FeOx在外加EMF作用下发生明显的振荡现象能较大程度改变细胞膜表面的电势分布，从而改变Na+，K+，Ca2+等离子通过细胞膜表面的速度和方向，Ca2+代谢与细胞的凋亡相关，Na+，K+与细胞死亡和DNA代谢相关［10］。同时，纳米FeOx在磁场作用下发生振荡能导致明显的热效应［11］，导致细胞发生凋亡或死亡以及导致细胞DNA发生明显的代谢紊乱。37 nm FeOx在外加EMF作用下对Bel7402的影响更为明显，在EMF作用下振荡更为剧烈［12］。
综上所述，不同粒径磁性纳米FeOx吸附在细胞表面并不能影响细胞的增殖，也不能导致细胞发生凋亡或DNA代谢紊乱；在SMF照射时，在磁场照射初期能提高吸附有纳米粒子的细胞增殖速率，当照射时间达到72 h时能导致细胞发生凋亡；在EMF照射时，吸附有纳米FeOx细胞的凋亡及死亡率急剧变大，表明磁性纳米粒子与EMF对细胞的作用有叠加效果，具有较小粒径的纳米FeOx在EMF作用下对细胞的影响更为剧烈。磁性纳米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制细胞的增殖。对纳米粒子在细胞表面的吸附率、与细胞的融合以及对细胞膜表面电势的影响及热效应还需进行更为深入的研究。
参考文献
［1］Xu J， Yang HB， Fu WY. Preparation and magnetic properties of magnetic nanoparticles by solgel method［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 309(1): 307-311.
［2］Viota JL，Durán JDG， GonzálezCaballero F， et al. Magnetic properties of extremely bimodal magnetite suspensions［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 314(2): 80-86.
［3］Hong RY， Pan TT， Han YP， et al， Magnetic field synthesis of Fe3O4 nanoparticles used as a precursor of ferrofluids［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 310(3): 37-47.
［4］Carpenter EE. Iron nanoparticles as potential magnetic carriers［J］. J Magn Magn Mater， 2001， 225(1): 17-20.
［5］Qu YQ， Yang HB， Yang N， et al.The effect of reaction temperature on the particle size， structure and magnetic properties of coprecipitated CoFe2O4 nanoparticles［J］. Mater Lett， 2006， 60(29/30): 3548-3552.
［6］David R， Peter A， Eric D， et al. Dermatan carriers for neovascular transport targeting， deep tumor penetration and improved therapy［J］. J Contro Rel， 2005， 109(1/3): 222-235.
［7］Yoshitsugu K， Yasuaki K， Tetsuya H. Magnesiumbased nanocomposite materials for hydrogen storage［J］. J All Com， 2006， 424(1/2): 294-298.
［8］Li F， Xu KW， Wang HC， et al. Effects of static magnetic field on human umbilical vessel endothelial cell［J］. J Med Colle PLA， 2007， 22(2): 106-110.
［9］阮晓声，梁中庆，张月芳，等.恒磁场环境对大鼠血液流变学特性的影响［J］.中华理疗杂志，2000，23(4): 218.
［10］Koelsch P， Viswanath P， Motschmanna H， et al. Specific ion effects in physicochemical and biological systems:Simulations， theory and experiments［J］. Colloids Sur A， 2007，303（1/2）: 110-136.
[摘要] 目的:探讨藤梨根正丁醇提取物对培养的人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用。方法:MTT比色法检测藤梨根正丁醇提取物在不同浓度(1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)及不同时间(24 h、48 h、72 h)对Eca-109细胞生长抑制作用， TUNEL法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应。结果:①藤梨根正丁醇提取物对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。②提取物对瘤细胞有明显的凋亡效应。结论:藤梨根正丁醇提取物能有效抑制人食管癌Eca-109细胞生长。
[关键词] 藤梨根/猕猴桃根；食管肿瘤；抑制；凋亡
Abstract:Objective To evaluate the inhibitory effect of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on human carcinoma of esophagus cells(Eca-109).Methods MTT colormetric assay was used to examine the growth inhibition of extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol on Eca-109 cells， TUNEL test was performed to observe the apoptosis induced by the extracts (1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml)on Eca-109 cells. Results ① The inhibitory effect of the extracts on Eca-109 cells was increased in a dose-and time-dependent manner. ②The extracts could significantly induce apoptosis of Eca-109 cells. Conclusion The extracts from Actinidia arguta by n-butyl alcohol could effectively inhibit Eca-109 cell growth.
Key words: Tengligen/actinidia arguta; Esophagus tumor; Inhibitory effect; Apoptosis
细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序性死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现细胞凋亡在许多疾病尤其在肿瘤的发生、发展及转归中起着重要作用，这为肿瘤病人的治疗提供了新的思路。随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观察及实验研究的深入，人们逐渐肯定了它对肿瘤治疗方面的疗效。其抗肿瘤作用机制有多方面，如抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨（软枣猕猴桃）Actinidia arg-uta(Sieb.teZucc.)Planch.或猕猴桃A.chinensis Planch.的根。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞有生长抑制作用，采用不同方法所得的提取物其抑制作用存在一定的差异[5-6]。本文通过观察藤梨根对培养的人食管癌Eca-109细胞生长的作用，以探讨藤梨根对人食管癌细胞的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料人食管癌细胞Eca-109细胞株购于上海市中科院细胞库，RPMI-1640培养基购于武汉天源生物技术有限公司，为Gibco公司产品(货号31800-022)；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品(批号050126)；实验用1∶250胰酶购于武汉天源生物技术有限公司，为Difco公司产品(批号020411)；四甲基偶氢唑蓝(MTT) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Duchefa分装(货号BS0880)；二甲亚砜(DMSO) 购于武汉天源生物技术有限公司，为Sigma公司产品。TUNEL试剂盒(编号ZK-8005) 购于北京中杉生物技术有限公司。
1.2 细胞培养细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，37 ℃、5%CO2条件下培养，24 h换液一次。
1.3 药物制备将藤梨根1 kg粉碎成粗粉，烘干备用。取藤梨根500 g，加入3 000 ml正丁醇中浸泡12 h；回流提取1 h，过滤；药渣再加2 000 ml正丁醇回流提取1 h；合并两次滤液，减压回收正丁醇至稠膏状，真空干燥；干燥品加蒸馏水500 ml，旋转加热溶解，制成饱和水溶液；灭菌；原液(500 ml，1 g/ml，pH=3.8)。将原液稀释成1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml三个药物浓度；过滤；灭菌；分装，置4 ℃冰箱备用。
1.4 MTT法将贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后计数，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔板，待24 h细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇提取物药液。实验组分别加入终浓度为1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml 3个药物浓度的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每组l2复孔，分别于加药后第1、2、3 d测定各孔的吸光度值(A值)。测定前每孔加5 mg/ml的MTT 20 μl，温育4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl /孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定A490值。用各组的平均A值计算细胞生长抑制率。生长抑制率=（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100%。
1.5 TUNEL法检测凋亡细胞将浓度为4×104/ml的Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的干净盖玻片上，用RPMI 1640培养基于37 ℃、5%CO2条件下在24孔板中培养24 h后取出盖玻片，PBS冲洗3次。0.1%Triton-100破膜、4%多聚甲醛固定，H2O2阻断。用TDT法将生物素标记的d-UTP在末端转移酶的作用下，标记到DNA的5′端缺口上，再用亲和素标记的HRP与之结合，然后加入底物DAB显色，苏木素复染，从而使凋亡细胞核呈现棕褐色，未凋亡细胞核呈蓝色。在光学显微镜下随机计数5个高倍视野约1 000个细胞中的凋亡细胞数， 计算凋亡细胞所占比例。
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2 结果
2.1 MTT法检测生长抑制率结果表明藤梨根正丁醇提取物对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。用1 μg/ml的正丁醇提取物作用24 h，细胞生长抑制率为18.5%；当延长至72 h时，抑制率上升至45.3%；而100 μg/ml的药物作用72 h时，可使85%以上的细胞生长受到抑制（见表1）。
表1 藤梨根正丁醇提取物对Eca-109细胞的生长抑制率（略）
2.3 TUNEL法检测细胞凋亡当用1 μg/ml藤梨根正丁醇提取物处理Eca-109细胞24 h时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞；当药物作用时间延长至72 h时，可见凋亡细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成新月形，此为晚期凋亡细胞，随时间的推移，凋亡细胞比例逐渐增加（见图1）。而对照组，未见有明显凋亡现象（见图2）。
3 讨论
肿瘤是危及人类生命的首要顽疾，药物治疗为中西医肿瘤治疗中的一个重要模式，包括化学药物和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定，其机制有多方面，如抑制DNA合成、抑制肿瘤血管形成、诱导细胞分化、促进细胞凋亡、调节机体免疫功能、抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）活性等[1-4]。关于藤梨根的研究已有报道，其对消化系统肿瘤有良好的抗肿瘤作用，可用于消化系统肿瘤的治疗[5]，但其抗肿瘤作用机制还不清楚。初步研究发现，同种猕猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同。有学者用甲醇、水、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂回流提取， 观察提取物对同种肝癌细胞株的作用， 结果表明正丁醇、乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有较好的抑制作用， 但各组量效关系不明显[6]。关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成分， 曾有人报道主要为三萜类化合物， 分别为乙酸乙酯提取物熊果酸、β-谷甾醇及正丁醇提取物2α，3α，24-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、2β，3β，23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸、24-hydroxytormentric acid[7]。研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。钟振国[8]等采用MTT比色法、集落形成法等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株Hela、神经肿瘤细胞株NG108-15、胃癌细胞株SGC7901等进行了研究，结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用。李昊[9]等研究了藤梨根对人胃低分化腺癌BGC-823细胞的作用，发现其浓度在1.3 mg/ml时抑瘤率最强(88.19%)，随着药物浓度的降低，抑瘤率随之下降；藤梨根对胃癌细胞作用24 h抑制作用最强(87.6l%)，48 h回落，72 h再次上升， 其对胃癌细胞有明显杀伤作用。卫培峰[10]等在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋亡， 与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异。 近几年来，国内外对细胞间隙连接通讯与癌变的关系进行了大量的研究，发现多数肿瘤细胞无此功能，其间隙连接少或无，而邻近的正常组织或良性肿瘤的间隙连接正常，少数肿瘤细胞有脆弱的连接通讯，但很容易受到破坏，其间隙连接数量很少，藤梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长[11]。本研究结果证实：藤梨根正丁醇提取物三个药物浓度1 μg/ml、10 μg/ml、100 μg/ml作用于Eca-109细胞24 h、48 h、72 h后，显示出明显的凋亡特征。TUNEL法可检测到不同时期的凋亡细胞；MTT法也发现随药物浓度升高和作用时间的延长，其抑制率明显升高。因此推测，诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调控及信号传导极其复杂，有多种分子参与。故抗肿瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验尚需进一步深入研究。
(文中图1~2见封四)（略）
[参考文献]
[1]
黄 河，刘宗潮.紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用[J].肿瘤防治杂志，2005，12（1）：75-78.
[2]
马吉祥，王勤忠，苏军英，等.大豆异黄酮诱导人食管癌裸鼠移植瘤细胞凋亡[J].中国肿瘤，2004，13(1):34-37.
[3]
Ohno S，Tachibana M，Shibakita M，et al.Prognostic significance of Fas and Fas ligand system-associated apoptosis in gastric cancer[J].Ann Surg Oncol，2000，7(10):750-757.
[4]
Nio Y，Iguchi C，Yamasawa K，et al.Apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax proteins in invasive ductal carcinoma of the pancreas[J].Pancreas，2001，22(3):230-239.
[5]
江苏新医学院主编.中药大辞典（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，1997：2 210-2 211.
[6]
韦金育，曾振东，吕 琳，等.中越猕猴桃根提取物抗肿瘤作用的实验研究[J].广西中医药，2003，26（6）：49-50.
[7]
覃益民，黄初升，陈希慧，等.中越猕猴桃根三萜成分的研究[J].中草药，1999，30（5）：323-326.
[8]
钟振国，张雯艳，张凤芬，等.中越猕猴桃根提取物的体外抗肿瘤活性研究[J].中药材，2005，28（3）：215-218.
[9]
李 昊，杨慧萍，杨 凡，等.藤梨根对胃癌细胞抑制作用的实验研究[J].河北中医，2004，26（4）：314-315.
[10]
卫培峰，焦晨莉，张 英，等.藤梨根对实验性大鼠胃癌抑制作用的实验研究[J].陕西中医，2005，26（8）：850-851.
1、细胞结构：在充分基础教学的基础上，制作细胞模型，一般可以采用不同颜色的橡皮泥制作成不同的形状，代表不同的细胞器，但是要考虑到合理性和科学性；
2、分子结构模型：DNA和细胞膜的流动镶嵌模型，可以利用不同大小的小球进行科学组装后，进行展示，既能掌握其物理结构，又能提供深入学习的可能。
注意：生物模型的制作是教学的重要一环，必须考虑其合理性和科学性，引导学生善于发问，及时解决制作过程中的问题。充分发挥学生的主观能动性，丰富教学环节。有条件的学校和家庭还可以利用网络制作电子版的三维模型。
（来源：文章屋网 ）
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