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关键词 基因工程；研究进展；原理；应用
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）10-0045-02
20世纪70 年代以来，基因工程技术在世界范围内蓬勃兴起，至今已在多个学科领域得到广泛应用。基因工程是一项能够较好地服务于人类社会的工程技术，该技术通过改变生物的遗传组成，增加生物的遗传多样性，由此赋予新型转基因生物的表型特征[1]。目前，以基因重组和克隆技术为代表的生物技术正以日新月异的速度迅猛发展。
1 基因工程原理
基因工程（genetic engineering）以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代方法为手段进行的研究，又称为DNA重组或分子克隆。通过体外重组，基因工程将不同来源的基因导入受体细胞，在体细胞内实现基因的复制、转录、翻译。这种技术是按照人们的意愿将某一生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割，然后与载体DNA分子连接起来，一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中[2-3]。对于受体细胞而言，与载体相连的DNA分子就属于外源物质也称为重组体。重组体导入到受体细胞之后就可以进行正常的复制和表达，从而获得新物种。一般来说，载体的选择对能否成功进入受体细胞并且复制和表达起着很重要的作用，载体进入受体细胞应该以不影响受体细胞正常生长为基本原则。这种技术克服了远缘杂交的不亲和，为改造生物提供了有效的手段。
2 基因工程的应用
2.1 植物基因工程技术在中草药研发中的应用
2.1.1 提高药用植物的有效成分含量。目前，学者在铁皮石斛上应用了基因工程技术，以提高其有效成分的含量。由于人工合成成本很高，若能够通过基因工程技术提高石斛碱的含量，会产生巨大的经济效益。魏小勇等[4]以铁皮石斛种胚原球茎为研究材料，定向诱导后获得稳定的石斛碱突变体，分析突变体的表达效果，并以mRNA为模板反转录产生cDNA，构建铁皮石斛差减cDNA文库，获得差异表达mRNA反义基因。通过构建相应载体转化石斛，来分析转基因石斛中石斛碱的变化，通过筛选反义基因来确定石斛碱功能基因。将类似铁皮石斛的稀缺植物上应用基因工程技术，可为中草药的研发奠定基础[5]。
2.1.2 提高药用植物的抗病性和抗逆性。一般对药用植物都是采用大规模的种植，由此才能满足市场需求。应用植物基因工程技术可解决栽培过程中的病害问题。如种植培养出的抗病毒、抗虫害品种，可增强植物对病害的抵抗能力，不仅能降低植物病害的发生，还能减少由于使用农药而带来的污染[6]。Pilon-Smit et al[7]将SacB基因导入烟草，提高了转基因烟草的耐旱抗寒特性。我国学者也开展了植物基因工程技术的研究和应用，并取得了显著的成果。贺 红等[8]以枳壳实生苗上胚轴为研究材料，为获得转柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的植株，其采用了遗传转化技术。有学者还利用Ti 转化系统获得了多种抗病毒的植物，如抗黄瓜花叶病毒（CMV）的番茄和抗甜菜坏死黄脉病毒（BNYV）的甜菜等[9]。
2.2 基因工程在植物性食品脱敏中的应用
基因工程可以将目的基因导入受体细胞，也可以改变内源基因，只要找到需要删除的基因即可。过敏反应具有反应迅速的特点，过敏原种类也很多。因此，防止发生过敏反应也很困难。基因工程可以直接作用于过敏源头，即改变内源基因使编码的蛋白质失去致敏性。也可以通过基因工程方法处理食品及其原料可降低其致敏性，从而降低过敏病人的不良反应。反义技术可消除植物中内源基因，使致敏基因沉默，从而降低植物性食品致敏性[10]。
2.3 转基因技术在哺乳动物遗传育种领域的应用
随着分子生物技术的发展，人们可以根据意愿改良动物品种，结合基因技术原理的应用，由此实现重要的经济价值。在畜牧业生产上，主要是用于遗传改良，加速动物育种。转基因可以定向培育并保存物种的优良性状，并能加快其积累和保存的步伐。在大量的转基因动物中选出符合人们预想的转基因动物，利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，用于大量生产转基因动物。将转基因技术应用于家畜上，在动物体内转入结合特异抗原抗体基因，可生产出具有抗多种疾病性能的动物[1]。转基因技术的科技含量较高，但在实验室内也能实现动物育种。在动物杂种优势利用方面，转基因技术可加速动物育种的进程，增强选育种畜性状的稳定性，降低育种的时限并提高效率[11]。
2.4 基因工程在食品工业中的应用[12-14]
2.4.1 糖类的改良。淀粉是一种多糖，通过对酶的调控可控制其含量水平，ADPP葡萄糖焦磷酸酶、淀粉合成酶和分枝酶是高等植物的淀粉合成酶。将淀粉系土壤大肠杆菌的基因转移到马铃薯上，可增加马铃薯的淀粉含量[12]。这种基因可表达ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，使马铃薯淀粉含量增加近20%[15]。目前，利用植物基因工程技术改善食品的风味已取得重大的进展。Monsanto公司开发出转基因马铃薯，新型马铃薯产品的淀粉含量较传统品种平均提高了20%～30%，油炸后的产品具有更好的构质和风味，并且油味和吸油量都较少[16]。
2.4.2 改善发酵食品风味。发酵食品具有工业经济效益，其品质将直接影响效益。但是在该领域不能广泛地应用传统的微生物，否则不能达到定向改造微生物性状的目的。因此，选择的微生物将决定发酵食品风味。随着分子生物学的兴起，在分子水平上可利用DNA 重组、RNA 干扰及基因敲除等基因工程技术来构建所需的基因工程菌株[17]。
例如，在啤酒和酱油的生产工艺中可利用转基因技术改善产品的风味。在酿造酱油的过程中，氨基酸的生成量对整体风味起决定性的作用，参与该反应的羧肽酶和碱性蛋白酶的基因已克隆并成功转化到菌株中，羧肽酶的活力可大幅提高13倍，碱性蛋白酶的活力可提高5倍，从而提高氨基酸的生成量[18]。为满足不同食品的需要，在酱油的酿造工艺中可使用工程菌株，由此降低酱油的色度和口味。啤酒中含有一种叫双乙酰的物质，双乙酰是啤酒酵母细胞产生的α-乙酰乳酸经非酶促的氧化脱羧反应自发产生的，当双乙酰含量超过风味阈值（0.02~0.10 mg/L）时，就会大大降低啤酒的口感，产生馊酸味，进而影响经济效益。为改善啤酒的风味，可采用α-乙酰乳酸脱羧酶去除双乙酰。研究表明，利用转基因技术将编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆到啤酒酵母中进行表达[15]，可以有效降低啤酒中的双乙酰含量。基于基因工程原理，还可将转基因技术应用于制取其他产品[19]。
3 展望
目前，基因工程技术已渗透到人类生产生活的各个领域，其以巨大的生命力发挥重大的影响，一些实验室技术和成果不断地得到应用，也将使地球的生物圈变得更加丰富多彩[20]。如今基因工程技术在给人类带来利益的同时，对于疾病的治疗方面也有了巨大突破。尽管基因工程技术给人类带来了巨大的利益和便利，但同时也应该思考转基因食品的安全性问题，这是对基因工程未来发展的最大挑战[21-22]。
4 参考文献
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[3] 黄雅琼.猪体细胞核移植相关技术研究[D].南宁：广西大学，2008.
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[20] 谢秋林.基因工程在体育运动中应用的新进展[J].军事体育进修学院学报，2009（2）：116-118.
笔者根据课标要求，结合考纲和近年高考考点将近年基因工程考点总结如下。
一、 基因工程的基础知识
基因工程的理论铺垫――分子生物学发展：
① 艾弗里证明了DNA是遗传物质。
② 沃森和克里克证明了DNA双螺旋结构。
③ 尼仑贝格破译了遗传密码。
二、 酶切
基因工程选择限制性内切酶作为工具，主要是因为它具有比一般酶更高的专一性。由于其具有较高的专一性，因此在基因工程的具体操作中如何选择限制性内切酶是高考的重点考察内容。
1. 限制酶的特异性
例1 判断用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸是否可行？_____。
答案 不可行
解析 限制酶的专一性非常强，其特异性表现在三个方面：识别DNA、识别特定序列（回文）、切割特定位点磷酸二酯键。由于烟草花叶病毒是RNA病毒，所以限制酶不能识别RNA。
另外要特别注意限制酶切割以后的结果，磷酸二酯键断裂，暴露出新的磷酸基团。
2. 限制酶的选择
正确选择限制酶是基因工程中一件非常重要的任务。限制酶的选择应当遵循以下一些原则：不破坏目的基因；不破坏标记基因；目的基因和运载体上都有限制酶的切割位点。当然也要注意用一种限制酶和两种限制酶切割的区别。
例2 与只使用EcoR I相比较，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_________
______________________。
答案 质粒和含目的基因的外源DN段自身环化
解析 基因工程中目的基因和质粒可以用同一种酶切，也可以用两种酶切，若用一种酶切，质粒只要切一个切口，目的基因需要切两个切口；若用两种酶切，质粒要切两个切口，目的基因也需要切两个切口。一种酶切出的4个切口都相同，所以有多种连法，两种酶切出的质粒和目的基因上的4个切口两两相同，因此可以防止自身环化。
3. 同尾酶
限制酶种类多样，一些酶之间关系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ识别不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它们切出的末端可以连接，被称为同尾酶。
例3 已知限制酶I的识别序列和切点是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。根据下图示判断下列操作正确的是（ ）
A. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
答案 A
三、 连接
1. 连接物类型
经过限制酶切割过以后，暴露出的相同的黏性末端可以自动连接，考生同时需要考虑：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因两端的两个黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；质粒上的两个黏性末端。综合以上结论，连接产物的类型可能就比较多，如目的基因-目的基因连接物、目的基因-运载体连接物、运载体-运载体连接物、其他DN段-运载体连接物、目的基因自连、运载体自连，若用同一种酶切时后两种连接物不存在。
2. 连接酶
下表简要总结了基因工程中常见酶的特性差异。
例 PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_____________
___________________。
答案 DNA聚合酶只能将单核苷酸连接到双链DN段的引物链上
解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么连接酶能否催化以上反应呢？也不能，因为连接酶必须将两段DNA相连。RNA聚合酶能否催化以上反应呢？也不能，因为RNA聚合酶虽然不要引物，但其不能催化T参与反应，只能利用U。虽然这些酶都是催化磷酸二酯键，但它们作用的底物差异较大，所以一定要注意辨析。
以上主要介绍了基因工程的三种操作工具，这些内容当然是高考的重点和热点。除此之外有些内容也应当给予一定关注，如：目的基因的获取；目的基因的扩增（PCR）；土壤农杆菌介导的目的基因的导入；重组质粒的筛选；目的基因的检测；转基因生物的安全性；转基因生物的利用等问题。
巩固训练
1. 目前人类利用基因工程的方法成功培育出转基因抗虫棉，以下说法正确的是
（ ）
A. 标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因
B. 抗虫基因导入棉花叶肉细胞后，可通过传粉、受精的方法，使抗虫性状遗传下去
C. 苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因与质粒结合后直接进入棉花的叶肉细胞表达
D. 转基因抗虫棉经过种植，棉铃虫不会产生抗性，这样可以有效消灭棉铃虫
2. 下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。
（1） 将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X-1混合连接，连接后获得的质粒类型有______。（可多选）
A. X-1 B. X-2
C. X-3 D. X-4
（2） 若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上。在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有____________、____________。
（3） 如果X-1用E1酶切，产生850对碱基和3 550对碱基两种片段：那么质粒X-2（Tcr基因的长度为1 200对碱基）用E2酶切后的片段长度为______对碱基。
（4） 若将外源的Tcr基因两端用E2切开，再与用E2切开的X-1混合连接，并导入大肠杆菌细胞，结果显示，含X-4的细胞数与含X-1的细胞数之比为13，增大DNA连接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________
________________________。
3. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。请回答下列问题：
（1） 将提取的质粒与外源DNA分别加入缓冲液中，选用相应的限制酶处理时，影响处理效果的外界因素主要是______等（写出两点）。
（2） 用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA？答：______，原因是______
___________________________。
（3） 可选用______（两种）限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得______种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含______的培养基上培养。
（4） 为了从基因文库中分离获取T2噬菌体抗性基因，将重组质粒导入对T2噬菌体敏感的大肠杆菌，然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有______的培养基上培养，从而初步检测目的基因的表达。
答案
1. A 2. （1） ABC
（2） 无质粒细胞 含X-3的细胞
（3） 4 750
（4） 不能 DNA连接酶对DN段没有选择性或者DNA末端相同
3. （1） 温度、pH
（2） 不能 MspⅠ会切割质粒上的两个标记基因，而BamHⅠ会切割破坏目的基因
基因工程在医学上已得到广泛应用，并且应用领域不断被拓宽，取得了令人惊喜的成就。
1 基因工程制药
基因工程制药开创了制药工业的新纪元，解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在，人类已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是，具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。众所周知，医治侏儒症的良药是人生长激素，倘若从人的尸体中获取，治疗一个病人就需要600具尸体的脑下垂体才能获得足够的量；倘若运用基因工程生产，就可从每升基因工程菌液中得到2．4g。人们为此而石破天惊的兴奋!成本如此之低，又如此之高产，其巨大的经济效益和社会效益，由此可见。
2 基因工程抗病毒疫苗
为人类抵御病毒侵袭提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血热病毒疫苗、轮状病毒疫苗等应用于临床，提高了人类对各种病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的问世，使我国新生儿不再遭遇乙型肝炎病毒的侵袭，也降低了人群肝癌的发病率。又如，为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”，就是按照人类的设计，把“生物导弹”发射出去，精确地命中癌细胞，并炸死癌细胞而不伤害健康的细胞。就单克隆细胞而言，单克隆细胞在肿癌的诊断检测、显示定位、监测病变、监测疗效等方面也有重要价值。人类还通过基因工程生产抵御各种病菌、血吸虫、虐原虫等疫苗，提高人体对各种传染病的免疫力。脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世，变革了机体的免疫方式。如今，人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)疫苗的早日问世。基因工程抗体技术的发展，为克服单克隆抗体生产细胞株在生产过程中的不稳定性，为生产大量高效抗病毒疫苗提供了先进的生产工艺。
3 基因工程治疗疾病
临床实践已经表明，基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如，不治之症——白痴病，用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因，就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传疾病约有4000种，包括单基因缺陷和多基因综合征。运用基因工程技术或者基因打靶的手段，将病毒的基因杀灭，插入校正基因，得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。人类精心设计的基因工程操作，克服了不同个体甚至物种之间由于器官移植所产生的免疫排斥作用，实现人体之间的移植已获成功，成功的实体器官移植有肾、心、肝、胰、肺、肠，也有双器官和多器官的联合移植。而人体与动物之间的器官移植成为现实，临床应用已是指日可待的事了。脱氧核糖核酸化学合成的完善和自动化，脱氧核糖核酸扩增技术的优化，为合成基因“探针”，提高临床诊断的质量，是人类所殷切企盼的。基因治疗有两种途径，一是体细胞的基因治疗，二是生殖细胞的基因治疗。体细胞的基因治疗是将正常的遗传基因导入受精的卵细胞内，让这种遗传物质进入受精卵的基因组内，并随着受精卵分裂，分配到每一个子细胞中去，最终纠正未来个体的遗传缺陷。而生殖细胞的基因治疗是将人类设计的“目的基因”导入患有遗传病病人的生殖细胞内，此法操作技术异常复杂，又涉及伦理，缓行之理充足，故尚无人涉足。
4 基因工程诊病
关键词：植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望
叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。
1叶绿体基因工程概述
1.1叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。
1.2叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。
1.3叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。
1.4叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。
2叶绿体基因工程的应用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。
2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。
3叶绿体基因工程存在的问题
3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
4展望
虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。
5参考文献
[1] 刘良式.植物分子遗传学[m].北京:科学出版社,1997.
[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.
[3] 李宏韬,赵淑青,赵彦修,等.叶绿体基因工程简介[j].遗传,2003,25(4):495-498.
[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.
[5] 沈桂芳,倪丕冲.植物叶绿
关键词植物叶绿体;基因工程;发展;应用;存在问题;展望
叶绿体作为植物中与光合作用直接相连的重要细胞器,其基因组的功能也因此扮演着十分重要的角色。1882年straburger观察到藻类叶绿体能分裂并进入子代细胞;1909年baur和correns通过在3种枝条颜色不同的紫茉莉间杂交得出,质体是母本遗传的。人们便开始对叶绿体遗传方面产生了浓厚的兴趣[1]。1988年boynton等首次用野生型叶绿体dna转化了单细胞生物衣藻突变体(atpb基因突变体),使其完全恢复光合作用能力,标志着叶绿体基因工程的诞生[2]。叶绿体基因工程作为一种很具有发展前景的植物转基因技术,在植物新陈代谢、抗虫性、抗病性、抗旱性、遗传育种等方面都将有着越来越重要的意义。
1叶绿体基因工程概述
1.1叶绿体简介
叶绿体是植物进行光合作用的重要器官,是一种半自主型的细胞器,能够进行自我复制,含有双链环状dna。叶绿体dna分子一般长120~160kb。叶绿体dna有ira和irb 2个反向重复序列(分别位于a链和b链),两者基因大小完全相同,只是方向相反,它们之间有1个大的单拷贝区(大小约80kb)和1个小的单拷贝区(大小约20kb)。
1.2叶绿体基因组转化优点
叶绿体基因具有分子量小、结构简单、便于遗传的特点,故相对于传统的细胞核遗传更能高效表达目的基因,这是因为叶绿体基因本身拥有巨大的拷贝数[3]。叶绿体基因可实现外源基因的定点整合,避免位置效应和基因沉默;遗传表达具有原核性;安全性好,叶绿体属于母系遗传,后代材料稳定;目的基因产物对植物的影响小。利用叶绿体基因转化的这些优点,可以加快育种速度和效率,节约育种时间。
1.3叶绿体转化的主要过程
叶绿体转化过程通常分4步:一是转化载体携带外源目的基因通过基因枪法或其他转化体系导入叶绿体;二是将外源表达框架整合到叶绿体的基因组里;三是筛选具有转化的叶绿体细胞;四是继代繁殖得到稳定的叶绿体转化植物[4]。
1.4叶绿体转化的主要方法
依据叶绿体转化的主要过程,生物学家相应地研究若干种叶绿体基因转化的方法,其中常用的叶绿体转化方法:一是微弹轰击法。将钨粉包裹构建完整的质粒载体,用基因枪轰击植物的各种组织、器官,然后对重组叶绿体进行连续筛选,不断提高同质化水平,最后获得所需的转基因植株[5]。二是农杆菌t-dna介导的遗传转化法。将外源目的基因、选择标记基因等构建到农杆菌的ti质粒上,然后通过与植物组织或器官共培养,最后把所需外源基因转化到叶绿体并获得表达。三是peg处理法。只需将构建好的质粒(含外源基因、标记基因、同源片断、启动子、终止子等)在一定的peg浓度下与植物原生质体共培养。
2叶绿体基因工程的应用
2.1提高植物光合效率
植物的光合效率非常有限,太阳能的很小一部分可以转化为植物所需要的能量,从而转变为人类需要的产品。植物光合效率取决于rubisco酶的丰富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人们可以通过2种直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循环过程;二是提高酶的特性,减少光呼吸浪费的能量[6]。很多科学家正试图通过提高rubisco酶来提高植物的光合效率,而其中拟南芥和水稻的定点整合试验取得了重大突破,证明叶绿体基因工程是生产高光合效率作物植物的最有价值的方法。
2.2合成有机物质
由于叶绿体型转基因植物具有环境安全性好、底物丰富、产物区域化等优点,已被越来越多的人关注,并成为工业化生产特定有机物质的可靠场所。例如,有科学家已发明了用叶绿体基因工程表达聚3-羟基丁酸酯合成相关基因的方法。聚3-羟基丁酸酯及其他类型的聚3-羟基链烷酸酯同属于聚酯类物质,是自然界中多种细菌的碳源及能源储备物。具有生物可降解性,如取代化学合成塑料将能从源头解决塑料废弃物引起的“白色污染”。其通过构建了含phbb、phm、phbc和aada基因表达盒的叶绿体整合及表达载体,通过基因枪轰击法转化烟草。northem点杂交、rt-pcr分析结果表明,叶绿体型转基因植株中目的基因在转录水平的表达明显高于核转化植株中相应基因。
2.3生产疫苗
人类治疗用蛋白质可以在叶绿体中实现表达,表达效率取决于外源基因的整合位点,增强转录和翻译的调控元件以及外源蛋白的稳定性等。人类已经在用叶绿体基因生产疫苗方面开展了卓有成效的工作。例如,范国昌等将甲型肝炎病毒vp3p1区和丙型肝炎病毒c区融合,并导入到衣藻叶绿体基因组中,融合蛋白得到高效表达,且具有双抗原活性。而霍乱病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已经在叶绿体中转化成功,预示着转基因植物疫苗的可商业化前景。tregoning等将tetc基因在烟草叶绿体基因组进行表达,为了增加mrna的稳定性及在烟草叶片内表达的可行性,他们将基因进行了密码子优化,分别表达了未经改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表达量分别为总可溶蛋白的25%和10%。
2.4在植物抗性方面的研究
在抗虫性方面,kota和cosa分别于1999年、2001年将btcryzaaz基因转入烟草叶绿体,前者可100%杀死4 000多倍抗性的抗性虫,后者报道bt表达量达46.1%。在抗逆性方面,人们通过编码sod、apx等酶的基因已经转入到烟草、苜蓿、马铃薯、棉花的叶绿体中,提高了植物的耐氧化能力,从而提高了植物对环境胁迫的耐受能力。
2.5叶绿体基因组在系统发育学上的应用
叶绿体在系统发育学上的优点:一是叶绿体基因组是仅次于核基因组的第二大基因组,为比较研究提供了一个较大的数据基础;二是叶绿体dna的核酸置换率适中,在应用上很有价值。然而,用叶绿体dna研究系统发育也存在着明显的不足:一是叶绿体基因组是母性遗传的,因此并不能单靠叶绿体基因组来解释居群间的杂交现象;二是虽然有越来越多的叶绿体dna被用作分子标记来研究类群间的系统发育关系,但只有将这些分子片段提供的信息与其他的分子片段信息、传统的形态及生理特征结合起来获得更多的信息,才能更接近系统发育的本来面目。
2.6叶绿体基因在消除环境忧虑问题上的前景
当今最为普遍的问题就是外源基因从转基因作物到杂草的逃逸,这一逃逸主要是通过花粉的扩散,产生超级杂草或产生和其他作物之间的基因污染,对环境极为不利。叶绿体基因工程产生的基因逃逸现象的风险远远低于核转化作物,因为大多数作物中的质体dna都是母系遗传,这样就可以避免作物和作物、作物和杂草之间的杂交,消除人们对基因污染的忧虑。
3叶绿体基因工程存在的问题
3.1叶绿体基因转化在杂合体上的稳定性问题
由于高等植物的每个细胞中有10~100个叶绿体,每个叶绿体内有10~100个叶绿体基因组拷贝,因此转化的叶绿体和未转化的野生型叶绿体同时存在于转基因植株中,造成这种杂合体在遗传上是不稳定的。在转化外源基因之前,目前可采用降低叶绿体拷贝数、高压筛选和选用致死突变体作为外源基因的受体等方法使转基因植株易于同质化。
3.2植物的种类有待扩展
可能是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。目前,已成功转化的植物种类很少,只有番茄和烟草通过有性生殖使外源基因获得稳定遗传,而番茄却是唯一能有高的外源蛋白积累的可食用果实的植物。
4展望
虽然在叶绿体基因工程领域人们已经取得了一定的进展,但对于改变叶绿体基因工程中所存在的缺点,科学界仍然要有大量的工作需要进行。为此,寻找更多更加合适的方法来改进叶绿体基因工程,使其优点更加明显,必将在未来生物技术领域带来又一场革命,为人类造福。
5参考文献
[1] 刘良式.植物分子遗传学[m].北京:科学出版社,1997.
[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.
[3] 李宏韬,赵淑青,赵彦修,等.叶绿体基因工程简介[j].遗传,2003,25(4):495-498.
[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.
关键词：基因工程;实验室建设;管理
中图分类号：G647 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）41-0270-02
实验室是高校开展大学生和研究生实验教学的主要场所，也是高校教师开展科学研究的重要平台，是一所大学教学、学科建设和管理水平的重要体现（袁继红等，2011）。通过实验室开展的实践教学是培养学生动手能力、创新能力以及理论联系实际的基本途径。基因工程是现代生命科学研究领域中一门极其重要的学科，我校生命科学学院开展的基因工程教学主要依托农业生物工程研究院的科研平台进行，对基因工程教学实验室进行建设和管理，期望达到教学、科研资源共享的目的。为此，以科研平台建设的是教学实验室有其不同于常规单一教学实验室的管理模式，能使大学生有更多的机会了解学科前沿和实际研究状况，在验证性实验的基础上融进创新性实验内容。经过几年的实践探索，在提高参与实验学生动手能力及培养创新思维发挥了重要作用，尤其是对进一步攻读相关专业硕士学位或博士学位的学生更具有意义。
一、基因工程实验室的实验内容与教学目标
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术、遗传工程或DNA重组技术等，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有遗传特性，获得新品种，生产新产品的现代生物学技术。以基因工程操作步骤为主线，含有目的基因分离、克隆，载体构建、转化、筛选鉴定等实验内容，设置和选择实验内容时既要注重专业性和可操作性，又要突出先进性和系统性。在通过课堂学习理论以后，需要通过实验对基因工程理论有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA重组的原理和实际操作方法，并在实践中提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为学习相关专业课程以及从事生物技术相关领域的科学研究奠定基础。
我们所建设的基因工程教学实验室进行教学的目标是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。在教学中，我们以问题导向，充分调动教、学双方的主观能动性，积极组织学生参与实验的准备工作;在实验中，安排学生与教师共同讨论实验涉及的理论问题和实验内容可能应用的问题，指导学生分析总结实验结果和存在的问题。以培养学生兴趣为主，发展一批从事基因工程研究的后备力量，据不完全统计，继续深造读研的学生占总人数的30%以上。
二、构建实验体系，全面提高学生实验技能
基因工程实验内容主要包括基因获得、载体构建、基因导入、基因表达4个方面，但在进行实验教学时，往往不是完全直接以此4个方面开展实验。通过几年的本科基因工程实验教学经验，逐渐形成了以基因工程经典性、基础性实验为主，强调实验的连续性，并结合植物基因工程实验室研究设计实验。我们的做法是：
1.基因的获得，主要采用从克隆载体上酶切获得目标基因、通过PCR扩增目的基因、人工合成DNA序列。在基因分离、克隆这部分知识的实验室验证教学中，往往是安排“基因组DNA分离提取技术”、“RNA分离提取技术及cDNA反转录技术”、“基因酶切与DNA的琼脂糖电泳技术”、“PCR技术”、“电泳胶回收DNA技术”。
2.载体构建。这部分实验内容和基因获得部分是难以分开的，常常是将酶切后电泳回收的目标基因、RNA反转录的cDNA、人工化学合成的基因序列、PCR扩增的DNA序列构建在亚克隆载体上、或构建目标基因在表达载体上。这部分实验室教学内容主要有“载体构建技术”、“基因连接技术”等。
3.目的基因导入。根据受体细胞不同导入方法也不同，包括感受态细胞的制备、农杆菌介导转化法，基因枪法（或微弹轰击法），花粉管通道法以及显微注射技术等，结合本实验室研究内容，以植物细胞为主，利用农杆菌介导转化法，以模式植物烟草为受体材料，通过组织培养再生实验获得转目的基因烟草植株。
4.目的基因在宿主基因组上的整合、表达、检测及转基因生物的筛选，实验内容包括报告基因的组织化学染色、PCR扩增目的基因、southern blot、Northern blot、Western Blot等实验内容涵盖了基因工程的主要操作过程和内容，可使学术全面掌握基因工程技术。
结合本实验室特点，设置4个实验内容，包括DN段得连接、转化及酶切鉴定，农杆菌介导的植物遗传转化，转化植物的表型分析及鉴定，转基因植物的性状分析及基因表达产物提取和检测。从2006年开始，已经培养生物技术及生物科学专业的本科生600余人。
三、加强“物、教师、学生”管理，全面提高实验教学效率
仪器设备是基因工程实验得以开设的基础，本实验室仪器设备总值达到2394余万元，完全具备开展基因工程实验所需硬件条件。在实验过程中需要使用大量仪器，包括PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、恒温水浴锅等，种类繁多，价格昂贵，学生很容易因为不当操作导致仪器损坏，导致维修经费开支巨大，因此“物”的管理显得尤为重要，必须严格建立实验仪器台账，利用仪器管理软件对仪器出入库、维修及报废等做好记录，便于对每台仪器随时跟踪管理。严格按照“账、物、卡”管理，每台仪器责任到人，做好使用登记，定期组织老师对仪器进行排查和维护，保证学生实验的顺利开展。
教师和实验技术人员是实验教学的实施者，在注重培养学生独立开展实验的能力的同时，教学中要引导学生注意理论知识与实验内容的结合，要讲解清楚实验内容的基本原理、操作的关键步骤，甚至要指出可能的误操作引起的问题。因此教师和实验技术人员业务水平非常重要，目前本实验室已有从事基因工程教学工作教师10人，均获得博士学位，专职实验技术人员9人（含博士1人，在读博士3人）。
学生作为实验教学的主体，在实验设置时应充分考虑学生的水平和接受程度，要鼓励学生按照操作步骤进行实验操作，也要要求学生清楚每一步操作步骤的理论原理以及所使用仪器的基本性能和操作标准规程，才能完成好实验内容的学习，对于出现的问题能够有自己的见解。只有做到“物、教师、学生”三者的有机结合，才能提高基因工程实验教学质量。
四、展望
基因工程是一门新兴的学科，由于基因概念较为抽象，单凭课堂讲解很难完全掌握该门课程的理论基础和操作技术，需要开展相应实验教学，印证课堂教学内容，通过课堂教学-实验教学-知识回顾，才能真正理解基因工程技术的精要内容。
参考文献：
[1]袁继红，李香花，朱意，付家忠.高校生化与分子生物学实验室建设与管理的实践[J].中国现代教育装备，2011，（11）.
[2]赵宏霞，王金平.关于强化实验室建设与工作管理的思考[J].农业基础科学，2009，（15）.
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Discussion for the Construction and Administration of Genetic Engineering Laboratory in University
ZHAO Dan1，ZHAO De-gang1
（“The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education），Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou Province 550025”）
一、高中生物课程资源开发案例
教材是最重要的课程资源，它在课程资源的开发与利用中往往起到主导和疏导作用。因此尝试以学科知识为背景，不断分析课标和教材，明确教材中哪些内容与本市生物产业相联系。另外一个生物产业所应用的生物学原理是多层次多方位紧密相联的，因此又将高中生物必修和选修课本，打乱模块顺序，以本市生物产业资源为线索，将与高中生物课本相关的知识点串联起来，进行了高中生物本地生物产业课程资源和教材资源的整合。尝试通过参观调查，使学生加深对所学生物学原理和技术的理解，增强学生的应用能力及知识的迁移能力。通过体验企业文化，了解相关的职业和就业素质，增强学生职业意识和社会责任感。现举两例简要说明。
1.“发酵工程”课程资源——深圳金威啤酒酿造有限公司
对于微生物相关知识，看不见摸不着，内容细微而深奥，条件好的学校可以在显微镜下看看酵母，条件不好的学校学生根本不知酵母长什么样，对于微生物培养，发酵等知识，限于条件，高中学校也很难开设。学生通常只是通过书本的文字和图片，通过老师归纳出流程图，进行理解和记忆。学生学起来难于理解且很难将这些知识上升到一个感性认识。深圳金威啤酒酿造有限公司拥有目前国内最先进的啤酒生产技术和设备，其“不添加甲醛酿造”的绿色啤酒工艺带动了行业的科技创新与技术进步，被科技部列为国家科技成果重点推广项目。公司的污水处理站是市工业污水治理的样板工程。并且该公司是“深圳市工业旅游景点”之一，这为我们中学生学习微生物应用相关知识提供了良好的条件。
例如学生在参观调查时可以通过现场体验生产工艺的过程，了解微生物的类群，分离、纯化、培养、计数及保存方法；了解培养基的配制原则及种类，体验消毒和灭菌方法，联系种群生长曲线，思考为什么酵母发酵时要补充加料；联系无氧呼吸及有氧呼吸，影响种群密度的生态因子，思考影响微生物生长的环境因素，酵母发酵时需要控制的因素，体验质检人员如何对其质量进行控制；参观污水处理站时，体验其污水处理工艺，理解生物的净化作用，水体的富营养化及生态工程所遵循的协调与平衡原理等。并且可以激发学生讨论微生物在实际生活生产中的应用。这样不仅使学生在实践的过程中，自觉地把间接的理论知识与直接的感受和体验结合起来，加强了学生与生活、与社会的联系而且进一步拓展了学生的思维。
2.“基因工程”课程资源——深圳华生元基因工程有限公司
深圳华生元基因工程有限公司是国内最早研究基因工程并实现产业化的公司，成功生产国内第一例基因工程药物——重组人表皮生长因子(rEGF)。
基因工程相关知识涉及必修和选修两个模块，内容抽象深奥，虽然课本图文并茂，并且用了形象生动的比喻来说明基因工程的基本工具，如将限制性核酸内切酶、DNA连接酶、质粒类比成基因的“剪刀”“针线”“运载体”。但是只凭教师讲述是很枯燥抽象，学生也难以理解。而去到深圳华生元基因工程有限公司实地参观之后，对于这种分子水平的操作就有会有一个具体形象的感性认识，原来和自己所想的有太大的差别。在参观的过程中，学生不但对于基因是什么，在哪里，有什么功能，原核细胞和真核细胞的基因结构的区别，基因对生物性状的控制，基因表达的中心法则，获得目的基因的方法，DNA的复制，基因工程原理这些基础知识会有一个更深的理解。而且也可直观的感受PCR体外扩增技术，基因工程操作步骤，基因工程操作的工具，检测基因的表达时的方法。同时也会激发学生调查基因工程产品在社会中的应用情况、讨论转基因生物利与弊的兴趣，开拓了思维。
二、本地生物课程资源开发整合利用的体会
深圳市生物产业资源非常丰富，与高中生物相联系的本市生物产业课程资源还有许多，还需要教师不断地开发，通过实践上的应用实例，让学生身临其境，亲身体验，比单纯的应用间接的载体给学生呈现相关知识，更能使学生更好的理解了生物学原理，增强了学生的应用能力、理解力及知识的迁移能力，拓宽了学生的知识面，引导学生关注身边的生物现象，增加了学生学习生物的兴趣。
在参观调查中，不仅可以让学生的生物学知识有一个更深的理解，而且也可以让学生从中学习一些社会学经济学相关的知识。比如可以让学生了解该公司的企业文化是什么?调查该公司年产值是多少?经济效益如何?为社会提供了多少个就业岗位?有哪些职业岗位，就业条件是什么?该公司提出了哪些技术革新目标?在与生物技术从业人员的面对面的交流过程中，无形中指导学生的就业观，帮助学生了解相关的职业和学习方向，增强学生的社会责任感，为进一步学习和步入社会做准备。同时这也是新课程标准对高中生物教师提出的一个新要求。
一、种类
根据抗原性质可分为灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和转基因植物可饲疫苗；根据疫苗功效则可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。
1. 灭活疫苗。将分类离培养的病原微生物（多数为强毒株）用适当的化学试剂将其灭活但保留其免疫原性，与不同的佐剂混合后乳化制成灭活疫苗。目前，用于制备灭活疫苗的佐剂有矿物油佐剂和氢氧化铝佐剂。前者多用于病毒性疫苗，如当前使用的猪圆环病毒灭活疫苗、伪狂犬病毒灭活疫苗；用氢氧化铝作为佐剂制备疫苗静置后，会出现分层，疫苗在使用前摇匀即可，该佐剂多用于细菌疫苗。蜂胶佐剂多用于细菌苗和亚单位疫苗。
灭活疫苗的用途：①新分离的病原，短期内难以致弱。如高致病性猪蓝耳病灭活疫苗、猪圆环病毒灭活疫苗和兔瘟灭活疫苗。②血清型较多的病原，疫苗的保护力呈现血清型特异性，如猪胸膜肺炎放线杆菌（15 个血清型）、副猪嗜血杆菌（15 个血清型）、猪链球菌（35 个血清型）等。③变异频率高的病原，如新分离的口蹄疫Mya-98 株。
猪用灭活疫苗中，有猪伪狂犬病灭活疫苗、猪口蹄疫0 型（单价/ 二价/ 三价）灭活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗、猪圆环病毒灭活疫苗、猪细小病毒灭活疫苗、猪乙脑灭活疫苗、猪链球菌病单价( 二价/ 三价) 灭活疫苗、副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗和猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗等。
灭活疫苗的优点是安全性强，疫苗毒株无毒力返强的危险；多数疫苗的免疫接种效果不受仔猪母源抗体水平高低的干扰；贮存条件方面，一般需冷藏保存，不能冷冻。其缺点是需要免疫次数多，接种后局部反应略大，甚至出现接种部位污染，可引起局部炎症脓肿，影响接种效果，也降低局部的肉品质量。
2．弱毒活疫苗。
疫苗种类指将毒力下降或毒力完全丧失的病原微生物，与牛奶、明胶等佐剂混合后经过低温冻干后形成的疏松状制剂。严格意义上，此类疫苗不包含采用基因工程方法对基因组改变后引起致病性改变的微生物制备的弱毒疫苗。根据所含的疫苗毒株分类不同，可以分为以下几种：（1）细菌活疫苗：如仔猪副伤寒疫苗，猪丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。（3）猪支原体肺炎活疫苗。预防猪寄生虫的活疫苗尚未问世。
我国常用的弱毒活疫苗较多，如猪瘟活疫苗、猪伪狂犬病活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗、猪乙肝疫苗、猪丹毒活疫苗、猪肺疫活疫苗、仔猪副伤寒疫苗、猪马腺疫链球菌活疫苗等。
活疫苗的优点与缺点：优点是：（1）免疫途径多样：可通过肌肉注射、滴鼻、口服等途径免疫。（2）刺激产生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途径免疫后可刺激机体产生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在预防呼吸道感染和消化道感染中具有独特的作用，这是灭活疫苗无法比拟的，如沙门氏菌口服可以刺激机体肠道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激产生体液免疫和细胞免疫，免疫效果较为确实。（4）免疫次数少于灭活疫苗。（5）接种后局部反应低。缺点：受母源抗体的影响如猪瘟活疫苗、伪狂犬病活疫苗等；受抗菌药物的影响如仔猪副伤寒弱毒疫苗、猪丹毒- 肺疫二联弱毒疫苗和猪支原体弱毒疫苗等；活疫苗运输保存条件严格，需冷冻条件。
3. 基因工程疫苗。
利用分子生物学手段改造病原微生物的基因，获得毒力下降、丧失的突变株或构建以弱毒株为载体、表达外源基因的重组毒（菌）株，并利用它们作为疫苗毒株制备疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活载体疫苗。该疫苗与常规弱毒疫苗相比，主要区别在于后者采用常规技术，而非分子生物学技术，来致弱病原微生物，不确定其毒力致弱的分子机制。
作为基因工程疫苗载体的病毒或细菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、对靶动物和非靶动物是安全的，基因组庞大、可容纳外源基因，并高效表达。常用的活载体有：伪狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙门氏菌弱毒菌株、乳酸杆菌、胸膜肺炎放线杆菌弱毒株。我国在“十一五”期间，在“863”课题资助下，开展了以伪狂犬病毒为载体，表达猪细小病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性基因的研究。鉴于对其安全性的忧虑，我国规定转基因生物（包含基因工程 疫苗）必须经历实验室和野外安全性观察测试，获得安全证书后，方能进行疫苗学研宄，以申报兽用生物制品新兽药证书。目前，我国己经批准上市的基因工程疫苗有：猪伪狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、猪大肠杆菌K88-K99 基因工程疫苗。重组载体疫苗尚未正式上市。
4．核酸疫苗。
核酸疫苗产生于20 世纪80 年代。将病原微生物或寄生虫基因组中编码免疫原性蛋白的基因克隆到真核表达载体中制备重组质粒，这种质粒直接导入动物体内，利用宿主体内的转录翻译系统，合成该蛋白，剌激机体产生针对相应的细胞免疫和体液抗体，因而称之为DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大肠杆菌大量制备，成本较低。针对细菌病、病毒病和寄生虫病的DNA 疫苗报道较多。但基于是否整合到宿主染色体等安全性考虑，核酸疫苗多处于实验研宄阶段，尚未大量应用。RNA 疫苗是近几年才出现的一种核酸疫苗，主要在人类医学中，作为RNA 类药物，用于抗肿瘤研宄。在动物疫苗领域尚未见RNA 疫苗的应用报道。
5. 亚单位疫苗与合成肽疫苗。
利用物理化学方法提纯病原微生物中具免疫原性的组份，或者利用基因工程表达该组分，纯化后加入佐剂而制成。猪传染性胸膜肺炎的亚单位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供对所有15 个血清型的交叉保护力。我国使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有较强免疫原性的抗原片段，加入佐剂制成。该疫苗的优点是抗原组分单一，纯度高，免疫反应强，副作用低；能迅速针对新出现变异毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本较高。
6．转基因植物可饲疫苗。
将病原微生物中编码免疫蛋白的基因插入植物基因组中，获得表达病原微生物免疫原性的植物，再从植物中提纯蛋白用于注射动物或将植物直接饲喂动物，产生免疫力。用于表达免疫原性基因的植物主要是马铃薯、玉米、蔬菜、番茄、烟草和香蕉等，称为转基因可饲疫苗（ediable vaccine)。此类疫苗在口蹄疫（拟南芥、苜蓿和马铃薯为受体)、猪传染性胃肠炎（马铃薯、花椰菜和土豆为受体)、腹泻（烟草为受体）和轮状病毒感染（番茄和马铃薯为受体）等疾病防控中有研究的报道,但未见临床应用。目前的技术难题是：选择直接生食和贮藏方便的植物作为表达植株（烟草不适用于动物基因的筛选和优化其密码子和使用合适启动子，使其表达量满足疫苗免疫剂量的要求；免疫剂量免疫程序的确定；并设法提高口服后黏膜免疫效果。转基因植物可饲疫苗主要应用在胃肠道疾病中。
二、疫苗使用的注意事项
1． 建立在正确的流行病学调查基础上，有针对性选择所需疫苗，不可盲从。对于多血清型菌株感染，应选择与当地流行菌株血清型一致的疫苗，免疫效果要确实。
2．确保疫苗运输和使用过程中的冷链保障。如疫苗的物理性状己经改变，如分层现象，不可用手工混匀后再使用，应丢弃。
3．细菌活疫苗使用前后不可同时使用抗生素或有抗菌活性的中草药。
4．建议使用于健康猪群；正在发病猪群使用紧急接种，可能会加快处于疾病晚期猪只死亡，但是会缩短猪群的病程，因此要有心理准备。
5．制定合理的免疫程序，避免母源抗体干扰。不同疫苗接种之间至少间隔1 周。不同疫苗的同时混合使用，要先做小范围的观察，如无副反应，再大群使用。
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