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【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01
压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。
1临床资料
注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。
方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。
2结果
原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH2O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。
3讨论
本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。
结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。
参考文献
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【摘要】
目的： 建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法，探讨神经干细胞的基本生物学特性。方法： 取孕14 d胎鼠大脑皮层，吸管吹打机械分离制成单细胞悬液，采用无血清培养和胎牛血清诱导分化， 应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞。结果： 从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白（Nestin）免疫阳性并能在体外传代培养，血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白，诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin。结论： 分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin，并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能，属于中枢神经系统的神经干细胞。
【关键词】 干细胞 大脑皮质 细胞培养 细胞分化 胚胎 大鼠 Sprague Dawley
［Abstract］ Objective: To establish a method for isolation， cultivation， differentiation induction， and identification of neural stem cells (NSCs) from embryonic rat in vitro， and explore the basic biological features of these cells. Methods： The mesencephalon of rat with conceptus age of 13 days was taken out and dissociated into single cell suspension mechanically， and then cultured in serumfree medium. Fetal bovine serum was used to induce cell differentiation. The isolated cells and their progeny were observed by using immunofluorescence technique. Result： The isolated cells showed nestin positive reaction and could be cultured in vitro in series. After being induced by fetal bovine serum， microtubuleassociated protein 2 (MAP2) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) which are specific antigens in neuron and astrocyte expressed in these cells， and synatophymin， a specific signal of synapse， was also expressed in the differentiated neurons. Conclusion： The isolated and cultured cells are NSCs of central nervous system， and possess strong capability of proliferation and potency of multidirectional differentiation.
［Key words］ stem cells; cerebral cortex; cell culture; cell differentiation; embryo; rats， spraguedawley
传统观念认为，哺乳动物的神经组织只有死亡，没有再生能力。自从上世纪90年代初科学家们分离、培养出神经干细胞(Neural stem cells，NSCs）以来，人们相继从各种动物及人的中枢神经系统分离、培养了NSCs[1，2] 。NSCs的发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗思路和途径。2007年6月利用细胞分离、无血清培养、血清诱导分化及免疫荧光等技术，证明了本实验所分离的细胞群为NSCs，以期为进一步使用和研究NSCs奠定理论及实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F12、B27、胎牛血清购自GIBCO公司，bFGF、Nestin抗体、突触素抗体Snaptophysin购自SIGMA公司，MAP2抗体、GFAP抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司，倒置相差显微镜及荧光显微镜为NIKON公司产品。
1.2 NSCs的分离培养[3～5]
成年雌性和雄性SD大鼠各1只，体重220～260 g，雌雄合笼后，检查阴栓，见阴栓计为孕0 d；孕14 d时取胎鼠，在解剖显微镜下仔细分离获得胎鼠大脑皮层，再用DHanks液漂洗，用眼科剪反复切割组织，再用200目细胞筛过滤，收集入离心管中，反复吹打，制成单细胞悬液，经细胞计数后，分装入50 ml培养瓶中，细胞数约为1×106/ml。培养条件: DMEM/F12 6 ml+B27120 μl + bFGF12 μ1，37 ℃， 5%CO2; 每6～7 d传代1次。
1.3 NSCs的诱导分化
取第4代传代培养的NSCs，将其吹打成单细胞后，以5×104/片细胞密度种于经0.1%多聚赖氨酸处理过的盖玻片上，培养条件为: DMEM/F121.5 ml + B2730 μl + FBS 150 μl， 37 ℃，5%CO2，培养7 d。
1.4 免疫荧光单标法鉴定NSCs及其子代细胞
1.4.1 Nestin免疫反应阳性细胞
将悬浮培养的细胞团用4 %多聚甲醛固定30 min后涂在载玻片上，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入一抗Nestin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加入二抗兔抗羊TRITC(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
1.4.2 MAP2 、GFAP、Snaptophymin免疫反应阳性细胞
取诱导分化的NSCs的细胞盖玻片用4%多聚甲醛固定30 min，37 ℃烘干，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入一抗MAP2（1∶100）、GFAP（1∶100）和Snaptophysin（1∶100）后4 ℃过夜，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，分别加入二抗羊抗兔FITC(1∶100)和羊抗兔Cy3(1∶100)后37 ℃孵育1 h，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 NSCs的形态学特征及鉴定
由孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的原代细胞， 接种后立即在相差显微镜下观察，细胞呈悬浮的圆形状，边界清楚，折光性强，绝大部分单个存在。经6～7 d无血清加bFGF培养后，细胞呈球状集落， 95 %以上的NSCs球呈悬浮生长，细胞增殖旺盛（图1）。原代培养时，培养瓶中可见一些细胞碎片和一些贴壁的杂细胞，但经传代后，这些杂质均减少甚至消失，且生长状态良好。在相差显微镜下，NSCs呈球形或椭圆形，大小不一。经Nestin免疫荧光染色鉴定显示神经干细胞球呈红色荧光（图2）。
2.2 NSCs的诱导分化及其鉴定
胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定在NSCs培养液中加入10%胎牛血清3 h后，NSCs球即开始贴壁和分化，6 h后即可明显发现有突起从团块边缘长出，24 h后有少数细胞分化为有突起的细胞，以后分化的细胞逐渐增多，从细胞球周围迁移出，呈放射状排列（图3）；随着时间的推移，突起不断增粗与延长并互相连接成网状，7 d时在相差显微镜下NSCs球周围可见分化成胞体圆形丰满的神经元样细胞和突起粗大的胶质细胞样细胞。免疫荧光染色显示，在胎牛血清的诱导分化下NSCs能分化成表达各种相应特异性标志的终末细胞，即表达MAP2的神经元（图4）、表达GFAP的星形胶质细胞（图5）；同时，从NSCs分化而来的神经元能表达突触素（图6）。
3 讨论
NSCs是指在哺乳动物中枢神经系统内具有多向分化潜能和自我复制能力的一群细胞，由于具有广阔的应用前景而受到神经科学领域众多研究者的关注，在治疗恶性胶质瘤、神经系统损伤、中枢神经系统慢性退行性疾病（帕金森病、亨廷顿病）等方面已取得丰硕的成果[6～8]。
NSCs在哺乳动物中枢神经系统内分布非常广泛，本实验从大脑皮层取材，采用机械分离法来制备NSCs悬液，实验效果比较理想。NSCs悬液的制备有酶消化法和机械分离法，但以酶消化法使用居多。由于在实际操作中很难从客观上准确地把握酶作用的最佳时间点，往往导致消化不足而不易获得单细胞悬液；或消化过度造成细胞受损而导致细胞活力下降甚至死亡。并且，在NSCs表面具有针对许多神经生长因子的受体[9]，当采用酶消化法来获取NSCs时， 可能会引起细胞表面受损而致使一部分受体丢失，而这些受体对于NSCs 维持其干细胞的未分化状态是必需的。所以采用显微解剖和吸管吹打等机械分离方法来制备NSCs悬液是神经干细胞分离中较为理想的方法。
本实验发现在原代培养时，培养瓶中可见大量的细胞碎片和一些贴壁的细胞，但经传代3～5代后，这些杂质逐渐减少甚至消失。这主要是由于培养液中所含的bFGF只对NSCs具有促进分裂和增殖作用[10，11]，而其他杂细胞在该培养液中无法生长。因此，原代细胞中大部分非NSCs会发生死亡，而NSCs不仅可以存活，还可以分裂和增殖，形成神经干细胞球，从而经过多次传代后， NSCs可以得到纯化。
Nestin是神经干细胞的一个标志物，本实验培养的细胞通过免疫荧光观察培养的细胞球均呈Nestin免疫反应阳性，提示组成细胞球的细胞为NSCs。当在培养液中加入10％的胎牛血清后，NSCs可以分化为神经元样细胞和胶质细胞样细胞。免疫荧光显示，诱导分化7 d后NSCs可以分化为表达MAP2的神经元和表达GFAP的星形胶质细胞，证明了NSCs具有多向分化潜能。同时，本研究观察到从NSCs诱导分化成的神经元突起上有分化较好的串珠样排列的膨体，突触素免疫荧光染色阳性，显示其已经具备接受信息的结构基础，表明分化的神经元能够合成和运输神经递质，行使可能的生理功能[12]。
实验从孕14 d胎鼠大脑皮层分离培养的细胞团具备NSCs的三大特征：Nestin免疫反应阳性、分裂增殖能力和多向分化潜能，由此证明了所分离培养的细胞是NSCs。并且，由血清诱导分化而来的神经元具备一定的生理功能，可以用于进一步的实验研究。
参考文献
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【摘要】
目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。
【关键词】 细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂
【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.
【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。
1 材料与方法
1.1 动物
清洁级雄性Wistar大鼠(3周鼠龄，60～70 g)，吉林大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂和药品
低糖DMEM培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma 公司)。
1.3 分离和培养
Wistar大鼠麻醉后处死，浸泡酒精15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100 ml培养瓶中，5% CO2，37℃下培养24～48 h，换液，去除未贴壁细胞，2～3 d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。
1.4 透射电镜样品制备
将培养3代10 cm2培养皿中约2×106个细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送电镜室，脱水包埋并制作超薄切片，行透射电镜观察并拍照。
1.5 MSCs表面标记物检测
0.25%胰酶消化收获第3代细胞，收集1×106个细胞，洗涤1次，0～4℃预冷的70%乙醇1 ml边加入边摇匀，混匀后置于4℃冰箱待进行细胞表面标记物检测。检测时以1 ml PBS洗涤2次，加含10%山羊血清的 PBS常温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min去上清，与饱和浓度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光反应30 min，PBS 洗涤细胞，置于冰上，行流式细胞仪检测。
1.6 MSCs标记
将无菌的DAPI 储存液加入培养的MSCs爬片上清中，至终浓度为50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞爬片。
2 结 果
2.1 MSCs相差显微镜观察细胞形态
骨髓细胞接种于培养瓶后，约6～8 h可见MSCs细胞贴壁，呈圆形或多角形，换液后，贴壁细胞清晰可见，2～3 d后可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；6 d左右可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰。约14 d细胞融合80%～90%，呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养皿形成单层。见图1。
2.3 MSCs的鉴定及标记
第3代细胞表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。见图3。细胞经DAPI标记后，细胞核呈蓝色。见图4。
3 讨 论
由于骨髓的细胞组成复杂，细胞功能各异，其中MSCs含量很低，约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分离高纯度的MSCs是原代培养关键性技术。目前，获得MSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法〔4〕。而骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，且分离的MSCs贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的MSCs分离方法。
一般认为，间充质干细胞没有特异性表面抗原，整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要标志物〔5〕，而MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因此，实验选取MSCs表达阳性的指标CD29、CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标〔2，6〕。本研究选择了CD29、CD34、CD44和CD45进行检测，结果表明培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合MSCs的特点，经过传代，第三代可获得较高纯度的MSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究。
DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。移植细胞的标记是研究其在体内的定位不可缺少的，目前常用的标记法有DAPI标记法、溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法、染色体标记法、基因标记法。BrdU法存在只能标记增殖期细胞，且标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可以终生标记，但也存在操作繁琐，无法观察活细胞等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带绿色荧光蛋白（GFP）暼报告基因。但目前，实现报告基因在目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐、实验周期长、成功率低等困难，而从转基因动物取材又因为动物来源困难，在国内较少开展〔7〕。本研究表明，DAPI起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率。但随着标记时间的延长，其标记效率迅速下降，3 w以后绝大多数细胞失去标记。
本实验完善贴壁法建立Wistar大鼠MSCs培养体系，经鉴定细胞纯度高，可以为体内移植提供大量的种子细胞。采用DAPI 进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有MSCs 均已被标记蓝色荧光，提示DAPI 标记法敏感性好，标记效率高，可应用进行体内细胞移植的良好标记。
参考文献
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关键词：信息技术；妇幼保健院；政工干部培养
信息技术是伴随计算机和网络技术的发展而发展的，如今信息技术已经进入了发展的全盛时期，信息技术的发展对人们的生活、学习及工作方式产生了广泛而深刻的影响。在此背景之下，政工干部的培养工作也不免受到信息技术发展的影响，如何准确地把握信息技术发展水平及趋势对于政工干部培养产生的影响，科学利用信息技术的强大功能来提高政工干部培养的质量，是所有企事业单位需要思考的问题，妇幼保健院也不例外。
一、信息技术发展对妇幼保健院政工干部培养的影响
1.信息技术发展对政工干部素质提出了更高的要求
信息技术的发展使得信息化素质成为政工干部的基本素质之一，妇幼保健院的政工干部也不例外。信息化素质是指主体所拥有的各种信息品质，包括信息智慧、信息道德、信息意识、信息觉悟、信息潜能和信息心理等内容。信息化素质能让政工干部跟上时展的潮流，掌握最新的信息技术，也能让政工干部认识到信息的重要性而自觉地利用信息提高工作质量，培养政工干部终身学习意识。妇幼保健院作为医疗体系的一部分，一些医疗技术和医疗设备更新速度很快，政工干部必须具备较高的信息化素质才能捕捉到这些信息。具体来说，信息技术的发展要求妇幼保健院的政工干部全面提高自身素质，学好信息知识、掌握信息技能的同时，还要学习政工理论知识、医疗专业知识及人文社科知识等，培养政工干部的领导管理能力、沟通交流能力等。
2.信息技术发展对政工干部素质培养提供了新的条件
信息技术的发展改变了传统的信息的载体形式，拓宽了信息传播的渠道，极大地缩短了信息传播所需要的时间，使个人获得信息的成本大大降低，为政工干部的培养创造了有利的条件。首先，政工干部学习、沟通渠道更广。妇幼保健院可以在政工干部的培养课程中使用各种计算机辅助教学方式，它使课程内容更加生动有趣，能更好地激发政工干部的学习兴趣；依靠网络教学的方式还可以让政工干部充分利用网上丰富的信息资源，相互交流学习；此外政工干部还可以合理安排自己的学习时间，选择自己的学习方式，培养方式更加个性化。其次，政工干部利用信息的方式发生了改变。过去妇幼保健院的政工干部获取信息主要靠阅读各种纸质材料，现在政工干部阅读的载体扩展到网络信息，从文字扩展到图像、声音、三维等；在表达方式上实现了从直接手写到键盘输入、扫描等，包括直接复制或者删减其他文件；在计算方式上也不再需要人工计算，利用计算机准确又迅速减轻了政工干部数据统计分析的负担。
3.信息技术发展对政工干部素质培养带来的问题
首先，信息鸿沟现象比较严重。在妇幼保健院的政工部门中，政工干部的能力有高有低，在掌握和使用现代信息技术方面也存在较大差异，这给政工干部的信息培养课程增加了不小的难度。其次，网络信息量过于庞大。信息技术的发展使得，各种信息都能在网络上迅速传播，过量的信息会使人们很难找到自己所需要的信息，造成信息利用效率的下降，其中一些有害的信息更是严重影响政工干部的培养工作。
二、提高妇幼保健院政工干部培养质量的对策
1.定期完善政工干部培养方案
信息技术的发展变化是日新月异的，妇幼保健院要保证政工干部的培养紧跟时代的步伐就必须根据时代的变化对培养方案和教学计划进行全面的调整和修订，但是不能改变的是要始终强调培养信息化素质的重要性。培养方案的完善和修改可以从以下几方面入手：教学目标、教学内容、教学课程专题、教师师资、教学材料和教学组织形式等，要突出强调信息化素质的地位。
2.精心设计培养的专题体系
妇幼保健院政工干部培养的基本平台就是课程专题，怎样设计合理的课程专题也成为政工干部培养工作的难题，可以明确的是必须要依据信息技术的发展对各类政工干部知识能力素质的客观要求来建立课程专题体系，同时也要根据不同教学对象的性质、层次和类型做出调整。要根据政工干部的培养目标确定专题的类别和课时比例，各类专题都有围绕解决新时期思想政治教育工作来设计，专题设置和内容都要做到内容精干、素材新颖、实在管用，不仅要包括信息化知识和技术的课程，还要有其他方面的课题。
3.打造政工干部培养的环境条件保障体系
妇幼保健院可以从以下几个方面来支持政工部门的信息化工作。首先，配置完备的教学设施设备，包括计算机及网络、多功能教室等。其次，建设多样的信息化教学信息资源子系统，例如数字化图书馆信息资源、课程网络信息资源、教学管理信息资源等。
总之，为了让信息技术的发展更好地为妇幼保健院的政工干部培养工作服务，需要站在全局的高度将信息技术理论和方法应用到培养的全过程中，需要对政工干部培养的形式、内容、方法进行深刻变革，以提高政工干部培养的效率，全面提高政工干部信息化素质培养的质量和效益。
参考文献：
[1]周军、夏婷婷，论信息技术发展对政工干部培养影响及其对策，中国信息界，2012（05）
[2]梁晨，努力提高政工干部的信息素质，经济研究导刊，2010（08）
【关键词】 骨髓基质干细胞;诱导分化;成骨细胞
【中图分类号】R414.1【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。
材料和方法
1 材料
1.1 实验动物。成年wistar 大鼠,雌雄不限,体重150~180 g ,由浙江大学华家池动物实验中心提供。
1.2 实验试剂。胎牛血清,胰蛋白酶(Hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),B一甘油磷酸纳(Sigma,USA),地塞米松(Sigma,USA),维生素C(Sigma,USA),小鼠抗大鼠OC单克隆抗体(R-D,USA),兔抗大鼠CD4(BA0532)、CD44(BA0321)、CD54(BA0541)、CD105(BA1725)、Fibronectin(BA1772)、Collagen Ⅰ(BA0325)、EGFR1(B0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)
2 方法
2.1 BMSCs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%FBS的高糖DMEM培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。接种于培养皿中,置37℃、5%CO2培养。于72h半量更换培养液,以后每3d半量换液1次。加入成骨诱导培养液进行分化培养.对照组加入等量基础培养液。
2.2 免疫细胞化学检测rBMSCs的表面标志: 取生长良好的3~5代rBMSCs以1.2×105/ml细胞悬液以1ml接种于盖玻片,待细胞单层融合至65%左右时,细胞爬片采用SP检测。
2.3 rBMSCs成脂向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成脂诱导剂,取诱导30d后的细胞进行苏丹Ⅳ染色。
2.4 rBMSCs骨向诱导分化:取生长良好的3~5代rBMSCs接种培养,贴壁24h后换用成骨诱导剂,取诱导15d、30d后的细胞进行矿化结节染色。
3 结果
3.1 原代培养的BMSCs接种24h后,即出现零星贴壁细胞。72h后开始增殖,生长良好,贴壁较均匀。BMSCs呈纺锤状,有突起。约10d时,细胞汇合成片,其融合率可达到80%~90%,有接触抑制现象。
3.2 rBMSCs表达出许多的非特异性的表面标志物。DAB显色CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。
3.3 rBMSCs脂向诱导分化培养中细胞形态出现明显的变化:扁平,多为原盘状,可见细胞突起。细胞诱导10d后胞浆中出现致密的黑色点状物,被大量的“小白点”状的脂滴前体分割。14d后,出现少量高折光性脂滴,随着时间推进,不断增多并形成大脂滴。绿色滤光片下可见清晰的脂滴;苏丹Ⅳ染色显示红色脂滴。
3.4 rBMSCs骨向诱导分化培养中,诱导15d就有较多高折光性小颗粒沉积,并可见局部融合,30d时,可见大量结节,几乎覆盖整个细胞层。
4 讨论
骨髓基质细胞又被称为“间充质干细胞”或“骨源性干细胞”。近年来研究发现还可以分化为星形胶质、少突胶质细胞及神经元,所以又称为多潜能成体干细胞。分离骨髓间充质干细胞有多种方法:免疫磁珠分离法[1]和流式细胞仪法[2]因费用高、需骨髓量大、操作复杂而较少应用。全骨髓法[3]即贴壁细胞分离法虽方法简单但所获细胞纯度不高;密度梯度离心法[4]是根据骨髓中各细胞成分比重不同离心分离培养,简单易行,所获得的细胞纯度较高。
本实验选用密度梯度离心法分离培养的细胞经过3~5代的传代,细胞形态趋于一致;免疫荧光检测显示培养的细胞CD44、CD54、CD105、Fibronectin、Collagen Ⅰ、EGFR1阳性,CD34阴性。于文献报道[5]相一致。虽然这些不是特异性的细胞表面标志物,但可以用以鉴别参考。
多向分化潜能是骨髓基质干细胞最重要的生物学特性[6~7]。本研究表明分离培养的细胞在体外诱导的情况下,既可以诱导为脂肪细胞,又可以诱导成为成骨细胞。因此,体外诱rBMSCs骨向分化可以很好地模拟骨髓基质干细胞向骨祖细胞、成骨前体细胞、成骨细胞、骨细胞分化的整个过程,是体外研究成骨功能及骨代谢的理想细胞生物模型。
参考文献
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【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SS-d对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法检测肝细胞存活率。结果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS-d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用，其机制可能与SS-d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。
【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制
随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。
1 器材与方法
1.1 药品与试剂 SS-d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。
1.2 动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
1.3 仪器 CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
1.4 肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。
1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。
1．6 MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS-d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492 nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。
1.7 SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS-d组加入不同浓度的SS-d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的活性，MTT法测定肝细胞的存活率。
1.8 统计学处理 数据以 表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验，P
2 结果
2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol·L－1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明显，我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L－1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.2 SS-d 实验浓度的选择SS-d不同浓度时细胞存活率见表2，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2 不同浓度SS-d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
2.3 SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量明显增高，GSH-px活性明显下降；而给予SS-d保护后， 培养液中ALT水平明显降低；肝细胞MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高；并且肝细胞存活率明显升高。具有明显的剂量依赖性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。见表3。表3 SS-d对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA，GSH-px水平与对照组比较，*P＜0.01，与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
3 讨论
大量研究表明，乙醇对肝细胞损伤是通过自由基介导脂质过氧化作用进行的［3～5］。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基，自由基除直接损伤肝细胞外，可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常，大量肝内酶（ALT，AST）释放入血，并可抑制抗氧化剂谷胱甘肽的合成，减弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝细胞代谢紊乱，肝功能异常，肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性，最终导致细胞肿胀死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂质过氧化反应，才能保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的完整性。
SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS对实验性肝损伤具有明显的保护作用［7，8］。但对单体SS－d保肝作用研究报道较少。因此，我们利用乙醇制备体外肝细胞损伤模型，在细胞水平上对SS-d保肝作用机制进行探讨。本研究显示，模型组肝细胞培养液中ALT活性明显升高，肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量增加，GSH-px活性降低，细胞存活率明显下降，表明乙醇可引起肝细胞氧化损伤；给予SS－d保护后，和模型组比较，肝细胞培养液中ALT活性明显较低，MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高，肝细胞存活率亦有明显升高。提示，SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用，其机制可能是：①SS-d能增强机体内抗氧化防御能力，抑制自由基的产生；②稳定肝细胞膜系统，提高膜结构的稳定性，促进肝细胞增殖，防止肝细胞损伤和坏死。
【参考文献】
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2010年诺贝尔生物医学奖授予英国生理学家罗伯特•爱德华兹，以表彰他在“体外受精”技术领域做出的开创性贡献。
1978年，罗伯特•爱德华教授和同事一起成功地使第一例试管婴儿诞生，从此开创了生殖医学领域的新纪元。试管婴儿在20多年前也曾被世界舆论界视为洪水猛兽而大加抨击，但时至今日，这项技术已经被全世界绝大多数国家承认，堪称医学史上的一大奇迹。迄今为止，全球已有上百万试管婴儿诞生。
被誉为“试管婴儿之父”的英国剑桥大学教授罗伯特•爱德华说：“克隆单纯从技术上讲非常简单，就是把卵细胞中DNA去掉，然后将体细胞中的DNA移入其中。这在世界上任何一个试管婴儿实验室中都可以完成，困难在于如何降低克隆的危险。”
本文以此热点问题作为命题材料，对2011年高考生物试题进行单项预测。预测材料及其涉及的知识、试题如下：
1．试管婴儿
【知识链接】要做好有关“试管婴儿”的试题，除了书本上的知识外，还要掌握“试管婴儿”技术的有关知识。“试管婴儿”技术是通过将不孕夫妇的和卵细胞取出在试管中完全受精，并在试管中培养使其发育到囊胚期，再将胚胎移入女性子宫内使其发育成胎儿。
体外受精步骤包括：的采集与培养、卵母细胞的获取与培养、体外受精等操作技术。具体过程如下图:
哺乳动物胚胎发育的过程大体概括如下图：
例1 下列关于关试管婴儿的说法，不正确的是（）
A. 从良种母牛体内采集的卵母细胞都需要进行体外培养
B. 从良种公牛采集的需进行获能处理
C. 早期胚胎移植的意义在于提高优良母畜的繁殖率
D. 早期胚胎指的是由受精卵发育至原肠胚时期的胚
解析：本题考查了试管婴儿的相关知识。根据体外受精和胚胎发育过程图解可知，早期胚胎指的是由受精卵发育至囊胚时的胚。
答案：D
例2 据2008年1月17日《干细胞》杂志报道，某科学家使用了进行试管受精的年轻女性捐献的卵子，以及2名志愿者的皮肤成纤维细胞，成功克隆出了5个人体胚胎，进而可以开发出有研究价值的干细胞。请回答：
（1）上述过程中主要应用到的两项动物细胞工程技术为；若将某经过修饰的基因导入其中的部分胚胎干细胞，常用的方法是。
（2）在使用合成培养基进行胚胎干细胞培养时，通常需要加入等天然成分；在细胞培养时，要保证被培养的细胞处于一定的气体环境，所需要的气体主要有 。
（3）科学家欲进行胚胎分割移植，则应该选择发育良好、形态正常的或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针进行分割。
答案：（1）动物细胞培养、细胞核移植显微注射技术（法）
（2）血清（血清、血浆） 氧气和二氧化碳 （3）桑葚胚
2．克隆人研究
【知识链接】克隆人的基本原理是动物细胞核的全能性，包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。其基本过程为：
细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，伴随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。该技术形成重组细胞继而发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。
例3 下图为克隆人的示意图，据图回答：
（1）图中所涉及的现代生物技术有、和
等。
（2）下列有关胚胎移植的叙述正确的有（）
A.冲卵指的是从子宫中冲出胚胎，而非冲出卵子
B.只有供、受体生理环境高度一致，移入受体的胚胎才能被接受，并继续发育
C.供体和受体要进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
D.不同动物其胚胎移植的时间不同，人的胚胎移植最好在四个细胞阶段进行
（3）图中两个婴儿长大后，外貌、性格和其他特征与原型男人相同，这说明 具有全能性。
（4）使用培养基进行胚胎干细胞培养时，通常要加入等天然成分，除了保证被培养细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中，还需要保证细胞生活所需的；早期胚胎发育在阶段以前的细胞是全能细胞。
（5）图中从“内细胞团到胚胎干细胞”的培养过程中，必须用处理内细胞团，使之分散成单个细胞。干细胞形成组织、器官必须要进行 和 。
（6）在体外培养胚胎干细胞能否获得动物器官?
。为什么？
解析：（1）该图利用了细胞核移植、动物细胞培养、胚胎分割移植等技术。（2）冲卵一般是指是胚胎收集中的冲卵――胚胎、早期胚胎。供体和受体只有保证具有相同的生理状态，才能保证胚胎的正常发育。（3）克隆过程说明动物细胞核具有全能性。（4）动物细胞培养液的成分包括葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH（36.5±0.5℃，7.2～7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。（5）动物细胞培养过程常用胰蛋白酶处理组织，以使之分散成单个细胞。（6）胚胎干细胞在体外培养条件下一般只能增殖进行细胞分裂，不能发生细胞分化。
答案：（1）核移植 胚胎移植 细胞培养（另外写细胞融合、胚胎分割也对，写了三个则给满分）（2）ABD（3）动物体细胞核 （4）血清 温度和pH 桑葚胚（5）胰蛋白酶 细胞的分裂 分化 （6）不能 胚胎干细胞在体外培养条件下可以增殖而不发生分化
3．生物技术中的伦理问题
【知识链接】生物技术引发的伦理问题包括克隆技术引发的伦理问题、试管婴儿引发的伦理问题、基因检测引发的伦理问题。中国政府对于克隆技术的态度是禁止生殖性克隆人，不反对治疗性克隆人；对于试管婴儿的态度，中国卫生部的规定是实施体外受精、胚胎移植及衍生技术必须获得卫生部的批准证书。
例4下图所示为人类“治疗性克隆”的大致过程。请回答下列问题：
（1）图中①为 细胞，过程A是目前实现体细胞克隆的关键技术，该技术称为 。
（2）图中③能诱导分化出神经细胞、血细胞、肌肉细胞，其根本原因是 的结果。这样培育得到的组织器官进行自体移植的最大好处是 。
（3）若应用转基因技术治疗遗传性糖尿病，可将健康人的控制胰岛素合成的基因导入结构④中的
，原因是这些细胞 。
（4）在用PCR技术扩增胰岛素基因时，缓冲溶液中必须加入的物质有：、分别与两条模板链结合的两种引物、 以及四种脱氧核苷酸。DNA的合成方向总是从子链的延伸。
（5）我国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆研究。为什么要反对生殖性克隆（即克隆人）呢？请你写出一条理由： 。
解析：从图可以看才出，治疗性克隆是将患者的体细胞的核与卵细胞的细胞质进行重组， 形成重组细胞，将重组细胞经过培养得到囊胚，取囊胚内细胞团培养得到不同组织器官，可用于进行自体移植，不会产生免疫排斥反应。
答案：（1）次级卵母（卵） 核移植
（2）基因选择性表达不会产生排异（免疫排斥）反应
（3）内细胞团分化程度极低（或具有全能性），可使外源基因在相应组织细胞表达
【关键词】 消化液； 添加物； 牛胚胎干细胞； 克隆效率
胚胎干细胞（ES细胞）是具有全能性的哺乳动物早期胚胎细胞或原始细胞。胚胎干细胞在分化抑制的培养条件下，可以未分化状态无限增殖。近年来有关牛类ES细胞分离与克隆的研究已经取得较大进展[1-2]。笔者为探讨添加物和消化液对牛胚胎干细胞克隆效率的影响，通过从牛鲜胚内细胞团（ICM）中分离获得牛类ES细胞后进行克隆，在培养细胞中添加胰岛素生长因子和消化液，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 牛胚采集 在自然期，对健康经产黑白花奶牛母进行人工受精后68 d经非手术方法从牛子宫取胚胎。将待采集胚胎的母牛固定在床位上，在尾椎硬膜外腔注射 2% 盐酸利多卡因麻醉。按规定方法在冲洗两侧子宫角。冲出的胚胎要在立体显微镜下检查。在100倍实体解剖显微镜下观察受精卵的形态、色调、分裂球的大小、均匀度、细胞的密度、与透明带的间隙以及变性情况等[3-4]。
1.2 溶液配制 细胞基础培养液：DMEM+0.1 mM 2-mercap-toethanol（在此基础上，添加不同浓度的血清及各种细胞因子）；细胞基础消化液：胰蛋白酶+EDTA（在此基础上，两者浓度有所调整）。
1.2.1 饲养层制备 选取新生健康黑白花牛犊制备成纤维细胞，取3代内对数生长期MEF， 终浓度10μg/ml 丝裂霉素C处理 3.5 h， D-PBS充分洗涤，消化细胞调整细胞浓度为1×105个/ml，种植在经 0.1%明胶包被的4孔培养板中，置37 ℃、5% CO2培养箱培养待用，用前更换成胚胎干细胞培养基。
1.2.2 胚胎处理和胚胎培养条件 基础培养液为DMEM培养基+15%NBS+0.1mmol/L 0.1 μmol/L Na2SeO3+β琉基乙醇。室温下培养牛胚胎及ES细胞。
1.2.3 ICM初次传代 将ICM细胞体外培养6～7 d后，当细胞繁殖到一定数目时，选择未分化的细胞进行传代。操作如下：用玻璃针剥离覆盖在ICM表面的滋养层细胞后挑出ICM，用PBS洗涤液清洗后，置入0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液中处理后，将细胞转入15%的血清培养液中，制备细胞团悬混液。培养条件同上。
1.2.4 牛ES细胞继代克隆 ICM细胞培养35 d后，饲养层表面可出现类似ES细胞的集落。弃去培养液，用PBS液洗涤集落，再用玻璃针剥脱隆起明显、排列紧密的ES细胞集落，再用毛细吸管将集落移入培养液中。
1.3 研究方法 在DMEM培养基中加入10 ng/ml的IGF（设为IGF组）观察牛ES细胞的克隆结果与未加IGF（设为对照组）时做比较，在离散ICM和ES集落时，分别用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液（A组）和0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液（B组），作用时间控制为2 min，温度37 ℃。
1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计处理，计数资料采用 字2检验，以P
2 结果
不同条件对牛ES细胞克隆的影响情况，具体结果见表1。
3 讨论
胚胎干细胞具有全能性，能再体外条件下分化为各器官系统细胞，亦可在分化抑制的情况下进行未分化状态克隆，胚胎干细胞克隆技术广泛运用于转基因动物、嵌合体的制作和克隆动物的生产，目前有关牛胚胎克隆的研究取得了重大进展[4-5]。为探讨不同条件对牛ES细胞克隆的影响，笔者探讨了在不同浓度消化液及在胰岛素生长因子作用下，牛ES细胞克隆的变化。牛ES细胞在以上配置的培养液中培养形成ES细胞集落胚数/枚ES 2枚，细胞最大传代数2代。在培养液中加入10 ng/ml的IGF牛ES细胞集落胚数为3枚，细胞最大传代数4代，可见IGF对牛ES细胞克隆有促进作用。在ICM细胞与ES细胞分离时用0.02%EDTA消化液+0.125%胰蛋白酶消化液处理2 min，形成ES细胞集落胚数/枚ES 9枚细胞最大传代数4代。用0.04%EDTA消化液+0.25%胰蛋白酶消化液分离牛ES细胞集落胚数为8枚，细胞最大传代数4代。因此，在分离ICM细胞和ES细胞时注意，选择适当浓度的消化液，且作用时间不宜过长[6-8]。通过本实验可得出在进行牛ES细胞培养时，可利用一定的添加物促进ES细胞克隆，促进其繁殖，而对于分离ICM和ES细胞的消化液，须严控其浓度和作用时间。
参考文献
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