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原发性血小板增多症是多能造血干细胞的克隆性疾病，是指血小板计数多在1000～3000×109/L的一种骨髓增殖性疾病，病变主要表现在巨核细胞.血小板系统，出血和血栓形成是发病和死亡的主要原因[1]。我科2008至今应用美国百特公司生产的CS3000血细胞分离机为65例原发性血小板增多症病人行血小板分离术，迅速减少血小板数量，改善症状取得了较好的疗效。
1 临床资料
65例中男38例，女27例，年龄28-91岁，均行血象，骨髓象检查, 均符合国内的诊断标准[2]，患者均有不同程度的高粘滞血症，神智清楚。
2 方法
应用美国百特公司生产的CS3000血细胞分离机及一次性消耗管道，选择血细胞单采程序，ACD抗凝剂，专用生理盐水，双针循环进行采集，全血处理血量5000Ml,全血流速30-50ml，ACD抗凝剂与全血比例为11∶1。
3 护理
3.1 单采前护理。
3.1.1 物品准备：CS3000血细胞分离机及一次性消耗管道，16号专用针头，ACD抗凝剂，专用生理盐水，10%葡萄糖酸钙，地塞米松，氧气，心电监护仪，及各种急救药品和器械。
3.1.2 环境准备：血细胞分离室使用前后均予紫外线照射30分钟，地面予500mg/L有效氯湿拖。
3.1.3 病人准备：做好心理护理，向病人介绍血小板分离术的治疗作用极其重要意义及单采过程中的注意事项，消除顾虑，观察病人的血管情况，指导病人保护好浅表大静脉，单采当天清淡饮食，适当多饮水2000ml/日。术前10分钟予10%葡萄糖酸钙20mL口服st预防枸橼酸钠反应。
3.2 单采术中护理
3.2.1 安装管道，连接ACD抗凝剂，专用生理盐水选择血小板单采程序，机器初始化备用，
3.2.2 置病人平卧位，安装好心电监护仪，氧气吸入3升/分，无菌操作原则行肘部大静脉穿刺，穿刺成功予妥善固定，指导病人双肘自然升直，勿乱动，必要时使用约束带。予地塞米松5mg iv st,单采过程中全血流速30-50ml,为保证病人血流畅通，足够血流量。予心理支持，稳定病人的情绪，避免血管收缩，并指导病人进血管侧肢体做有节奏的握拳和松拳动作、必要时予穿刺点上方绑加压袖带加压以保证血流量,单采过程中应密切观察病人的病情变化，如胸闷气急，出冷汗，血压下降等低血容量症状及手足麻木等低血钙症状，如有应予相应处理，本组病例无1例发生低血压症状，有9例发生轻度手足发麻的低血钙症状，予10%葡萄糖酸钙口服后缓解。
3.2.3 单采术后护理:治疗结束，予拔针后局部穿刺点加压包扎60分钟，肢体切勿用力支撑，以防血肿发生，本组病例无1例发生血肿。做好单采记录，观察病人的生命体征，病人的生命体征平稳，用平车护送回病房，继续平卧4-6小时，指导病人多饮水，与床位医生、责任护士严格交班，做到三班交接。回血细胞分离室撤去管道，保养机器。
4 体会
原发性血小板增多症是一种骨髓增殖性疾病，患者出现显著性持续血小板增多及功能障碍，并伴有红细胞和白细胞增多。红细胞压积、血小板计数及血小板功能是影响血液流变学的主要因素[3,4],血小板板单采术能使循环中血小板在短期内下降，已用于治疗原发性血小板增多症患者。在血小板单采术中，护理至关重要，术前做好心理护理，指导病人多饮水，能降低血液粘稠度，避免血管收缩，保证静脉穿刺后血流通畅，机器正常运行，术中密切观察生命体征变化，术后的健康指导，本组病人经我们精心护理，无一例发生严重不良反应，疗效满意。
参考文献
[1] Barbui T,Finazzi G. Management of essential thrombocythemi[J].Clin Rev Oncol/Hematiology, 1999,29;257
[2] 张之南,血液病诊断及疗效标准[M]1 第2版，北京：科学技术出版社，1998,289;290
真性红细胞增多症（PV）是指外周血液中红细胞数超过正常值，HB、HCT亦相应增高的一种原因不明慢性进行性骨髓造血活性普遍亢进的疾病，属于骨髓组织异常增生的肿瘤性疾病。临床表现以皮肤红紫和血管及神经系统为特征[1]。目前在治疗上无特效，其治疗原则是红细胞总量、总血容量接近或回复正常，缓解病情，减少并发症；以往传统的方法主要是行静脉放血及应用放、化疗，使血容量降至正常。但其不良反应大，放血后有引起红细胞及血小板反跳性升高的可能[2]，单放、化疗易使红细胞分解，引起溶解综合征。我科2011年3月至2013年12月对36例PV患者使用血细胞分离机进行红细胞单采术治疗，现将结果及护理报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本组患者共36例，男26例，女10例，年龄28～80岁。其中头晕头痛21例，肝脾肿大5例，高血压2例，脑梗死2例，右下肢静脉血栓1例，痛风1例，皮肤瘙痒1例。
1.2 方法
1.2.1 治疗方法 采用美国百特公司从CS-3000Plus连续流动式细胞分离机对每例患者进行红细胞单采术1～3次，36例PV患者共进行红细胞单采术54次。一次性分离管道为专用4R2210T，抗凝剂采用ACD-A，选择程序“3-淋巴细胞收集程序”。每次单采全血处理量为1 500～4 000 ml，全血流速为30～55 ml/min，ACD-A抗凝剂平均用量约为350 ml，处理时间平均为100 min。单采后加用羟基脲、α-干扰素或小剂量高三尖杉等药物治疗。
1.2.2 评定方法 单采红细胞前后均查血常规，取前后结果之差，比较用红细胞单采术治疗后红细胞计数，Hb、HCT的下降值。
1.3 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，红细胞单采前后用SPSS 10.0统计软件对检验数据配对t检验。
2 结果
PV患者红细胞单位采前后血常规改变，表略。
3 护理
3.1 术前护理
3.1.1 心理护理 术前充分了解患者的心理状态，并与之加强交流，讲解疾病的相关知识及红细胞去除术的治疗原理，使患者了解该项治疗的必要性和安全性，消除心理压力，主动配合治疗[3]。
3.1.2 环境准备 保持室温24 ℃～26 ℃，湿度约55%，采集前用紫外线灯照射30 min，并更换床单位，禁止室内人员走动，现场备常规抢救药物和器材。
3.1.3 细胞分离机的准备 专人管理，定期维护，安装不间断电源，以应对突发停电影响采集。采集安装管路前，分离机预热10～20 min。 表1 PV患者红细胞单采前后血常规比较
3.1.4 患者准备 采血管路通畅是红细胞去除术顺利进行的保证。采集前评估患者的静脉，常选择粗直弹性好的静脉做穿刺。要求患者采集前多饮水，且勿进高脂饮食。
3.2 术中护理
3.2.1 一般护理 采集中应有一名经验丰富的护士全程陪护，协助患者取舒适的，做好保暖，并让患者分散其注意力，缓解紧张情绪。并应严格无菌操作。
3.2.2 病情的观察 予以心电监护，密切观察生命体征的变化，每30 min记录一次血压、脉搏、呼吸，并观察全血流速、血浆流速，采集及回输速度控制在40～50 ml/min，如有不适，可适当减缓速度。
3.2.3 不良反应的护理
3.2.3.1 低钙反应 采血过程中应用的ACD-A抗凝剂，其主要成分为枸橼酸钠盐，枸橼酸根与血中钙离子可形成难解离的可溶性络合物，使血中钙离子减少，出现低钙症状；表现为口周发麻、恶心、腹部不适、面色苍白、心率下降等。我科采用单采开始后30 min予生理盐水20 ml加10%葡萄糖酸钙10 ml缓慢静脉推注，以预防枸橼酸盐中毒。出现低钙症状明显时，增加补钙剂量。单采过程中口周发麻5例，四肢抽搐1例，予上述对症处理后缓解。
3.2.3.2 血容量失衡 在单采过程中，如去除量和还输量未能达到平衡，可引发低血容量或循环血量超负荷症状。血容量失衡是治疗性血液成分单采技术可能致死的不良反应。因此，在单采过程中应对患者加强血压监护，红细胞采集速度不宜过快，开始采集前予输注生理盐水或林格液以稀释血液，但应控制输液速度。所有患者单采中未出现血容量失衡现象。
3.2.3.4 迷走神经反射 36例患者中有1例患者由于过度紧张在单采红细胞开试后约20 min后出现迷走神经反射。表现为恶心、呕吐、面色苍白、出冷汗，心率减慢为52次/min，血压下降不明显。予暂停单采，并予保暖，心理安慰，肌肉注射胃复安，约15 min后上述症状缓解。
3.3 术后护理 采集完毕后，尽可能回输管路内剩余的血细胞。因采血针头粗大，采集后为防止穿刺处渗血，拔出针头后要迅速用无菌纱布局部按压20～30 min，直至无血液渗出；深静脉穿刺要用肝素封管并做好护理。嘱患者平卧30 min以上，进食糖水、牛奶等，以补充循环血量。抽血查血常规，并将检验结果及时反馈给患者，以增加患者治疗疾病的信心。
4 讨论
方法：回顾性分析我院2011年7月至2012年12月收治的37例急性坏疽性胆囊炎中发生了围手术期并发症的患者，统计其并发症的发生率，就其临床特点和诊治经验进行总结。
结果：患者年龄与平均住院时间、术后并发症的发生风险没有明显关系，而对住院费用的增加有明显相关。
结论：通过加强围手术期的管理，及时、早期发现术后存在的各种指标异常、肺部感染、切口愈合不良并给予对症处理是患者早期痊愈的重要保障。
关键词：坏疽性胆囊炎 围手术期 并发症
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.08.219
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）08-0200-02
急性坏疽性胆囊炎是普通外科常见的急腹症之一，临床上起病急骤、病死率高，是随急性胆囊炎疾病进展导致的病情最为严重的阶段。其中，年龄、性别、糖尿病、肝硬化、白细胞计数、和胆囊增大是急性胆囊炎发生坏疽穿孔的独立危险因素。[1]围手术期各种并发症的发生是导致患者病死率高、住院时间延长、费用增加的的重要因素。在我院2011年7月至2012年12月收治的119例急性胆囊炎患者中，发生胆囊坏疽患者37人，经治疗后筛选出16例发生了围手术期并发症的患者入组，统计其并发症的发生率，就其临床特点和诊治经验进行总结，现报告如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料。本组16例，男8例，女8例；年龄14-84岁，平均52.75岁。发病至入院时间5h-7d。临床表现均有不同程度的右上腹疼痛伴腹膜刺激症状、发热、寒战及血象升高、B超提示胆囊增大。术后病理诊断均提示急性坏疽性胆囊炎。合并胆囊结石12例，无结石4例；胆总管继发结石1例。
1.2 手术方法。本组均于入院后经积极抗感染、解痉、补液支持治疗后再全麻下行手术治疗。手术方式为腹腔镜胆囊切除术1例，腹腔镜中转开腹胆囊切除4例，开腹胆囊切除7例，开腹胆囊切除+胆道探查术3例，剖腹探查+胆囊壁活检1例。手术时间1.0-4.6h，平均2.8h。其中1例行剖腹探查+胆囊壁活检术患者因失血性休克住院急诊手术，术中见腹腔出血500ml，胆囊窝部位血凝块，胆囊正常形态完全消失，仅于胆囊窝内凝血块中取出胆固醇结石60余枚，术后并发肺部感染、肺不张、I型呼衰转入ICU治疗呼吸机辅助呼吸、纤支镜吸痰后恢复良好、痊愈出院。另1例14岁男性患者因急性胆管炎入院，急诊行开腹胆囊切除+胆道探查、T管引流术，术中见肝脏呈弥漫性结节性肝硬化、部分结节质地灰白、质硬，胆总管明显扩张充血，打开胆管后取出暗红色质脆新生组织，术后病理报告考虑“胆管内新生组织”为恶性肿瘤并出血坏死，术后诊断原发性肝癌并胆管癌栓形成、急性胆管炎、急性坏疽性胆囊炎。术后患者恢复尚可，拒绝进一步放化疗，自请出院。
2 结果
2.1 各类并发症发生率见表1：
2.2 比较发病年龄对患者并发症发生、住院时间、及住院费用的影响。
术后经积极抗感染、护肝及应用呼吸机进行高级生命支持等积极治疗手段后，15例患者治愈出院。1例患者因感染中毒性休克并多器官功能衰竭，自请出院后第3日死亡。病死率6.25%。
3 讨论
急性坏疽胆囊炎发病的主要因素有：①胆囊管梗阻或胆道压力突然升高，高浓度胆盐可直接损伤胆囊粘膜，引起急性炎症改变；②合并细菌感染：一般通过胆道逆行性感染、多为肠道菌属；血源性感染较为少见；③重症胰腺炎，胰液反流等引起的化学性刺激；④在合并多器官功能障碍时的非结石性胆囊炎，胆囊粘膜受到低灌注、缺血缺氧性损害也是发生急性坏疽性胆囊炎的重要诱因之一。此类坏疽性胆囊炎多发生于高龄合并心血管疾病或代谢性疾病、严重创伤、感染等全身性严重疾病患者，胆囊穿孔、胆汁性腹膜炎发生率高，并发症及死亡率均较高。对此类患者诊治过程中我们体会到以下几点：
3.1 早期明确诊断，正确选择手术时机。急性坏疽性胆囊炎主要临床表现为腹痛，多为右上腹或中上腹的持续性胀痛，发热以及血象白细胞计数的明显升高，B超等影像学可见胆囊肿大、壁厚、部分呈双边影，胆囊周围炎性渗出等表现。但由于部分病人就诊时间晚或临床表现不典型，以不完全性肠梗阻、右下肺感染、弥漫性腹膜炎为主要症状就诊的患者不在少数，这就要求临床医生在查看病人时提高警惕，避免漏诊、误诊。在有些老年患者，由于胆囊位置较高而右上腹压痛不明显，腹壁松弛无腹膜刺激征，这时要注意肝区的叩击痛是否明显，通常肝区叩痛明显的部位即为胆囊部位。合并不完全性肠梗阻病人，上腹部CT的检查有助鉴别。部分病人胆囊坏疽穿孔后胆囊可以不大，胆汁性腹膜炎与胰腺炎引起的腹水有时难以鉴别，需要注意的是胆囊坏疽穿孔所致腹腔积液主要局限在右上腹，而胰腺形态改变不明显，必要时可重复多次腹腔穿刺甚至置管引流以鉴别。值得一提的是，在CT或B超检查中发现胆囊积气的患者，需高度重视怀疑坏疽性胆囊炎的可能，这与引起胆囊坏疽的致病菌产气荚膜梭菌有关[2]。
急性坏疽性胆囊炎一经诊断原则上应早期急诊手术治疗。正确的手术时机的选择对患者术后恢复有着重要的影响，有学者建议宜早期（
3.2 避免严重并发症的发生。坏疽性胆囊炎急诊手术术中最常见的并发症有出血、胆管损伤、胆管残留结石等。本组患者均行胆囊切除而术中均无胆管损伤或胆管残余结石病例，个人体会是在术中要注意操作轻柔、避免粗暴的解剖和大块组织的钳夹离断。对炎症粘连严重的患者必要时行逆行胆囊切除术。普遍认为逆行切除胆囊会导致术中出血量增加，但对于坏疽性胆囊炎病人，大部分合并胆囊终末血供障碍，有的病人甚至在胆囊切除后都无法找到确切的胆囊动脉。术中认清胆囊壁解剖层次，剥离胆囊时注意避免进入肝床是减少术中出血的技巧之一。另外术中出血还可能因盲目钳夹而导致胆管的损伤，因此精细的胆囊三角解剖十分重要。近三角区的分离避免长时间的电凝、手术中保持清醒的头脑，时刻考虑到是否存在解剖变异都是避免胆管损伤的方法。对于术中胆总管扩张、扪及结石或胆囊管增粗并胆囊内小结石的病人，术中胆管的探查也是十分必要的。如病情不允许胆囊切除时，因先抢救生命，同时行胆囊造口引流术，最大限度控制感染，待病情稳定后再行胆囊切除术。[5]通过加强围手术期的管理，及时、早期的发现术后存在的各种指标异常、肺部感染、切口愈合不良并给予对症处理是患者早期痊愈的重要保障。
3.3 手术时间与患者治疗效果的关系。通过对本组病例的统计研究我们发现，患者年龄与平均住院时间、术后并发症的发生风险没有明显关系，而对住院费用的增加有明显相关。
参考文献
[1] 龙涤，方富义，闭永浩，等.急性坏疽性胆囊炎的危险因素分析[J].实用医学杂志，2010，26（15）；2737-2739
[2] 黄洁，秦帅，毛恩强，等.坏疽性胆囊炎_重症急性胰腺炎的严重并发症之一[J].中国实用外科杂志，2011，30（1）；76-79
[3] 杨野，刘宇，郭仁宣，等.老年急性胆囊炎外科治疗时机和方式选择（附438例分析）[J].中国实用外科杂志，2008，28（5）；376-377
【摘要】 应用BALB／c裸鼠为移植模型，将在体外扩增的阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）病人的CD34+CD59+细胞进行移植，研究其增殖能力和重建造血的情况，为实现PNH患者进行临床自体骨髓移植（ABMT）或自体外周血干细胞移植（APBSCT）奠定基础。本研究利用免疫磁珠双阳性分选法，从PNH患者骨髓中分离出足够数量的CD34+CD59+细胞进行体外扩增，并将体外扩增的细胞输注给接受亚致死剂量照射的BALB／c裸鼠。结果显示：移植6周后，用流式细胞术和DNA检测方法均检测到裸鼠骨髓、脾脏和外周血中人的CD45+细胞，而接受PNH病人CD34+CD59+细胞移植后的裸鼠，其血常规指标有一定恢复，但并未完全恢复。结论：PNH病人骨髓CD34+CD59+细胞体外扩增后仍能保持造血祖细胞的生物特性，在照射的裸鼠中能重建造血。
【关键词】 阵发性睡眠性血红蛋白尿症
Nude Mice Intraperitoneally Transfused with Ex Vivo Expanded Bone Marrow CD34+CD59+ Cells from Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria
Abstract
Ex vivo expanded human bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) were transplanted into BALB/c mice in order to investigate their proliferation ability and reconstruction of hemopoiesis，and to lay the groundwork for clinical ABMT/APBSCT in PNH patients. CD34+CD59+ cells were selected from the bone marrow mononuclear cells in PNH patients by using immunomagnetic positive double sorting. Sublethally irradiated BALB/c mice were transplanted with CD34+CD59+ cells enriched from bone narrow of PNH patients.The results showed that human CD45+ cells were detected in the bone marrow，spleen and peripheral blood of the nude mice by flow cytometry and DNA analysis at 6 weeks post-transplant. Blood routine indicators of nude mice were found to recover to some extent，but did not fully recover. It is concluded that ex vivo expanded bone marrow CD34+CD59+ cells from patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria could keep their biological characteristics and ability to reconstruct hemopoiesis in irradiated BALB/c mice.
Key words paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；CD34+CD59+ cells；cell expansion；nude mice
阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种慢性溶血性疾病，其治疗长期以来一直停留在对症处理上，同种异体骨髓移植是目前唯一有效的根治方法，但由于HLA相合供体的缺乏、异体移植造成的免疫排斥和治疗费用的昂贵限制其广泛应用。因此，寻找有效的根治PNH的疗法是我们临床医生迫切需要解决的问题。由于PNH病人体内正常克隆与异常克隆并存，因此可以考虑对PNH病人进行自体骨髓移植（ABMT）或自体外周血干细胞移植（APBSCT）。PNH病人的造血祖细胞可以在体外收集，应用免疫磁珠双阳性标记的方法将正常细胞与异常克隆分开，对正常细胞在一定条件下进行体外扩增，待化疗和（或）免疫抑制剂尽量减少患者体内异常造血干／ 祖细胞后，再回输给病人重建造血以期根治PNH。我们以前的工作表明，应用免疫磁珠方法对细胞可进行两次分选得到高富集度的CD34+CD59+细胞，并对CD34+CD59+细胞进行体外扩增，但扩增的细胞能否在体内担当重建造血的重任？本研究以BALB/c裸鼠为动物模型对此问题进行了探讨。以裸鼠为动物模型对PNH患者造血细胞进行研究的问题，国内尚未见有报道。本研究的结果将会加深对PNH发病机制的认识，并为PNH根治途径的探讨提供重要的实验依据。
材料和方法
研究对象
8例PNH患者系我院门诊和住院的病人，均按文献〖1］标准确诊，经髂骨穿刺肝素抗凝获取骨髓。
CD34+CD59+细胞的［2］免疫磁珠双阳性法分离富集
常规分离骨髓单个核细胞(BMMNC)；CD34单克隆抗体标记及CD59单克隆抗体标记与免疫磁珠结合；用MiniMACS分选CD34+细胞；然后分离CD34+CD59+细胞及CD34+CD59-细胞；再用流式细胞仪测定CD34+CD59-细胞与CD34+CD59+细胞的比例。
细胞体外扩增培养
用本实验室成熟的体外扩增培养体系进行扩增［3］，分别于第4、7、10、14天半量换液，补充含相同细胞因子及浓度的IMDM（表1），取出细胞进行有核细胞计数，台盼蓝染色，进行CD34+CD59+细胞比例测定及各系造血祖细胞检测。CD34+CD59+细胞的扩增倍数由下述公式计算得出：
扩增倍数＝（扩增后的有核细胞数）× （CD34+CD59+％）÷扩增前的基数
裸鼠骨髓移植
BALB/c裸鼠（中国医学科学院动物所提供），雌雄各半，6-8周龄，体重16-20 g，所有裸鼠在相对无菌及无特定病原体条件下饲养于中国协和医科大学北京协和医院动物房。移植前3小时接受X线照射预处理，照射面积35 cm×35 cm，照距100 cm，剂量率200 cGy/min，照射时间2.00-2.75分钟，总剂量400-550 cGy［4，5］。
实验分组
实验组(8只)：经腹腔输注扩增后第7天含1×105的CD34+CD59+细胞；阴性对照组(4只)：输注等量的无细胞培养液。Table 1. Source and final concentration of rHGFs（略）
人造血祖细胞植入裸鼠体内的检测
按参考文献〖6］进行输注PNH病人CD34+CD59+细胞后6-8周用硫喷妥钠按50 mg/kg的浓度麻醉处死裸鼠。取外周血、两侧股骨的骨髓细胞及脾脏，用于人CD45+细胞的检测及抽提基因组DNA，以检测人特异的Alu序列，并进行人的造血祖细胞的分析。测定移植后血常规指标的变化，了解裸鼠造血重建情况。
统计学分析
运用SPSS统计软件处理数据，对二者间的比较用t检验，三者间的比较用单因素方差分析或两因素随机区组的方差分析。
结 果
PNH患者骨髓中CD34+CD59+细胞的分选
8例PNH患者应用免疫磁株双阳性分选法分选的CD34+CD59+细胞富集度为（85.73±5.42）％。根据以往的经验，造血祖细胞在扩增到第7天时扩增倍数最高。因此，本实验中细胞体外扩增仅7-10天。CD34+CD59+细胞第7天时扩增19.78±3.11倍。
裸鼠生存情况的观察
照射后存活的裸鼠在2-3周时均出现消瘦、皮肤散在出血点及干燥脱屑，3周后逐渐消失。PNH正常造血祖细胞（CD34+CD59+）体外扩增后输注组裸鼠均存活6周以上。
人特异性CD45+细胞的检测
实验组存活的8只裸鼠中均检测到人源性CD45+细胞，CD45+细胞数在外周血、骨髓及脾脏中分别为（3.10±1.24）%，（18.62±6.14）%，（15.65±2.45）%（图1）；在 阴性对照组裸鼠未检测到人CD45+细胞。
转贴于
造血祖细胞在裸鼠体内分化的检测
进一步分析裸鼠骨髓中CD45+的人的细胞可以发现各系表达的标志。在实验中我们检测到B系的表达（CD19+）、T系的表达（CD3+）、髓系的表达（CD14+、CD33+）以及祖细胞的标志（CD34+、CD38+）。它们分别占CD45+细胞的（13.35±1.81）%、（3.50±1.23）%、（6.32±1.32）%、（11.28±1.03）%、（1.54±1.14）%和（4.71±1.12）%(图2）。
特异性基因植入裸鼠的检测
以正常人的阳性标本作为阳性对照，阴性对照未检测到任何特异性条带，实验组小鼠的外周血、骨髓及脾脏组织中均可见到人的特异性Alu序列 (图3)。
移植后裸鼠外周血血常规的检测
阴性对照组在10-13天时的血象表现为三系细胞减低，尤以白细胞和血小板减少为显著。实验组在6-8周时的血常规检查显示，白细胞、血红蛋白及血小板并没有完全恢复，但较阴性对照组明显改善（表2）。阴性对照组白细胞及血小板数同实验组比较有显著差异（P0.05）。Table 2. Comparison of blood routine from BACL/c mice post transplant（略）
讨论
PNH是一种慢性难治的疾病，目前的治疗主要是对症治疗，异基因骨髓移植是目前唯一有效的根治方法。Saso等［7］报道了最大宗的临床试验，有57例病人接受了清髓性异基因骨髓移植，其中48例以HLA相合同胞兄妹为供者的患者，2年生存率为56％；2例以孪生姐妹为供者的患者移植后8年及12年仍然存活；7例无关供者中只有1例移植后5年仍然存活。19例（33.3％）在移植后4个月内死亡。治疗失败的主要原因为移植物抗宿主病（GVHD）和感染。因此，骨髓组织的相容性对移植成功至关重要。由于PNH病人体内呈异常造血与正常造血并存的状态，如果能利用PNH病人自身的正常造血部分进行ABMT或APBSCT，那么既能避免异基因骨髓移植中的GVHD，又不存在相合供体缺乏的问题，而能安全有效地治疗PNH［8］。但欲从骨髓及外周血中收集到足够量的正常造血祖细胞（CD34+CD59+）以供ABMT或APBSCT之需是非常困难的，为此必须对PNH病人的CD34+CD59+细胞进行体外扩增。为了给临床应用提供实验依据，必须将体外扩增后的PNH病人CD34+CD59+细胞移植给体重较小的动物，以了解扩增后的CD34+CD59+细胞在体内的生物学特性。
本研究采用磁珠双阳性分离方法，即有两种抗原标志的同一细胞被分离纯化出来。在无血清体外培养体系中经SCF、IL-3、IL-6、FLT-3、TPO、EPO组合作用后，PNH病人的有核细胞数、CD34+CD59+细胞及CFC均有不同程度的扩增。PNH患者CD34+CD59+细胞扩增第7天时有核细胞数可扩增137.22±8.54倍，CD34+CD59+细胞绝对值可扩增19.78±3.11倍，CFC扩增34.22±6.81倍。我们通过选择适宜的细胞因子组合及适宜的扩增时机，在体外培养的条件下，能够对PNH病人骨髓来源的正常造血祖细胞(CD34+CD59+)在数量上进行有效的扩增，那么扩增后CD34+CD59+细胞是否仍具有向多系分化重建造血的能力?肖娟等［9］对PNH病人骨髓CD34+CD59+的CD34+抗原表达情况及CFC进行研究发现:PNH病人的CD34+CD59+细胞的不同扩增时段（4、7、10、14天）的CD34+CD59+细胞与其相应的CFC相比较，呈正相关，说明扩增后的CD34+CD59+细胞仍具有形成CFU的能力，具备一定的重建造血性能。为进一步将体外扩增的CD34+CD59+细胞应用于临床，我们以BACL/c裸鼠为移植模型，并以该模型为基础，进一步分析了PNH病人造血祖细胞的生物特性。
虽然骨髓被认为是造血的主要部位，但PNH病人体外扩增的CD34+CD59+细胞移植给裸鼠后，其外周血、脾脏中均可检测到人的CD45+细胞，但其比例低于骨髓。应用流式细胞仪进行三色法分析CD45+细胞亚群中各系细胞的表达发现：裸鼠骨髓内的CD19、CD3、CD34、CD33、CD14的表达均为阳性，其中CD3的比例最低，为（2.54±1.14）%，这可能与裸鼠本身具有的T细胞免疫缺陷有关。
PNH病人正常造血祖细胞体外扩增后输注给BACL/c裸鼠，处死裸鼠后对其外周血象的检查发现，三系血细胞均未恢复正常，血红蛋白降低最明显，这可能与PNH病人本身存在的造血衰竭有关，而且体外实验也发现，PNH病人CD34+CD59+细胞的扩增倍数低于正常人。但同阴性对照相比仍有显著差异，说明PNH病人CD34+CD59+细胞经体外扩增后仍能保持造血祖细胞的特性并且能支持造血。对PNH病人骨髓来源的CD34+CD59+细胞进行体外扩增仍具有广阔的前景：①体外培养过程中产生的粒系及巨核系细胞可用于克服移植早期的粒细胞减少及血小板减少症。②所有PNH病人骨髓中造血祖细胞的数量仍少，不能达到基因治疗所需的靶细胞数量，但通过对PNH病人造血祖细胞体外扩增，则可能满足基因治疗的需要。
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关键词：丹参通络解毒汤；急性心肌梗死；单核细胞趋化蛋白-1；可溶性细胞间黏附因子-1；Toll样受体4；炎症反应；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0057-05
Abstract： Objective To explore the effects of Danshen Tongluo Detoxication Decoction on the inflammatory response of rats with bone marrow stem cell （BMSC） transplantation in acute myocardial infarction （AMI）； To discuss its mechanism of action. Methods The whole bone marrow adherent method was adopted for BMSCs separation and culture. The AMI model was established by closing the left anterior descending coronary artery of SD rats. After the modeling， SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group and BMSCs group （BMSCs transplantation group）， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group， 10 rats in each group. BMSCs cell suspension was injected directly into the edge of the myocardial tissue infarction area； Chinese medicine or normal saline were administered for gavage. 4 weeks later， the contents of MCP-1 and sICAM-1 in each group were detected by ELISA. TLR-4 expression was measured by Western blot method， and HE staining was used to observe the myocardial tissue pathological changes. Results Compared with the model group， the contents of MCP-1 and sICAM-1 and the protein expression of TLR-4 in BMSCs group， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group， and Danshen Tongluo Detoxication Decoction + BMSCs group decreased， Danshen Tongluo Detoxication Decoction group was better than BMSCs group （P
Key words： Danshen Tongluo Detoxication Decoction； acute myocardial infarction； MCP-1； sICAM-1； TLR-4； inflammatory response； rats
急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致残率逐年增高，成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。近年来骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）因具有取材方便、体外扩增能力强、可来源于自身、应用于临床的可行性高等优势[1]，成为治疗AMI新途径研究的热点。研究显示，BMSCs的应用可促进心肌组织细胞再生，刺激梗死区毛细血管新生，调节梗死区域心肌组织细胞的凋亡，改善心脏功能[2]。同时，有实验研究表明，中药干预BMSCs可调控BMSCs的归巢、定植以及分化，抑制BMSCs凋亡，为BMSCs移植提供良好微环境[3]。丹参通络解毒汤由丹参、水蛭、玄参、黄连等配伍组成，全方具有益气活血、通络解毒功效，临床治疗冠心病疗效显著[4]。为研究该方对AMI后大鼠的抗炎作用，本实验通过结扎冠状动脉左前降支的方法构建AMI大鼠模型，观察丹参通络解毒汤对大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、可溶性细胞间黏附因子-1（sICAM-1）含量及心肌组织Toll样受体4（TLR-4）蛋白表达的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
10～12周龄清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量（200±30）g，用于移植；4～6周幼龄大鼠20只，雌雄各半，体质量（100±10）g，湖南中医药大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（湘）2013-0005。大鼠采用普通饲料饲养，自由饮食，12 h/ 12 h明暗环境交替。
1.2 药物
丹参通络解毒汤（丹参15 g，檀香10 g，水蛭6 g，川芎10 g，当归15 g，红花10 g，玄参15 g，黄芩10 g，栀子15 g，黄连6 g，黄芪30 g等），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，由该院制剂室煎煮，浓缩至含原药材0.35 g/mL，共350 mL，4 ℃冰箱保存备用。
1.3 主要试剂与仪器
MCP-1、sICAM-1 ELISA试剂盒、TLR-4单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司；羊抗兔HRP标记二抗，上海碧云天生物技术有限公司。SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州智净净化设备有限公司；Galaxy型CO2培养箱，英国New Brunswick公司；倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯；多导生理信号采集系统，成都仪器厂；DW-2000型动物人工呼吸机，上海嘉鹏科技有限公司；mini protean 3 cell型电泳仪，BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 骨髓间充质干细胞制备和培养
从4～6周清洁级雄性SD小鼠股骨的髓腔中收集细胞，采用全骨髓贴壁法结合密度梯度离心法进行分离、培养。经多次换液和消化，将传至P3的BMSCs采用流式细胞仪检查细胞表面抗原，以CD34阳性率低于5%及CD90、CD44阳性率高于95%鉴定所得细胞为高纯度的BMSCs。
2.2 造模
参照文献[5]方法，大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后固定，气管插管连接小动物呼吸机，开胸暴露心脏，于肺动脉圆锥与左心耳右缘之间交点和心尖的假想连线中下1/3处穿线结扎。以心电图出现QRS波群增高增宽伴ST段抬高、心肌组织颜色发绀为结扎成功；以结扎部位以下心肌组织搏动减弱、颜色变苍白，及心电图显示肢体Ⅱ导联R波振幅升高、QRS波改变、J点偏移超过0.1 mV或出现病理性Q波，证实大鼠AMI造模成功[6]。
2.3 分组及给药
当P3或P4代大鼠BMSCs达70%～80%融合时进行移植。SD大鼠随机分为假手术组、模型组、BMSCs组、丹参通络解毒汤组（中药组）、丹参通络解毒汤+BMSCs组（中药+BMSCs组），每组10只。假手术组只穿线不结扎，其余各组进行AMI造模。BMSCs组和中药+BMSCs组冠状动脉结扎30 min后，于心肌梗死区边缘心肌组织3个位点直接注入共100 μL BMSCs细胞悬液（含细胞数3×106），假手术组和模型组则注入100 μL PBS。术后各组分笼饲养，给予常规饲料和饮水，48 h后，每日9：00中药组和中药+BMSCs组给予1 mL/100 g丹参通络解毒汤药液灌胃，其余各组用给予等量生理盐水灌胃，连续14 d。
2.4 心肌组织病理改变的观察
术后4周，大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血后，脱颈处死大鼠，迅速取出心脏，用冰生理盐水冲洗，取左心室缺血处心肌组织置于100 g/L多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，切片（厚4 μm），HE染色观察心肌组织的病理改变。
2.5 血清单核细胞趋化蛋白-1、可溶性细胞间黏附因子-1水平测定
术后4周，采集大鼠腹主动脉血5 mL，3500 r/min离心10 min，取血清，ELISA检测MCP-1、sICAM-1水平，严格按试剂盒说明书进行操作。
2.6 心肌组织Toll样受体4蛋白表达测定
提取心肌组织梗死边缘区心肌组织总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，电泳后电转于NC膜上，5%脱脂牛奶4 ℃封闭过夜。孵育TLR-4抗体（1∶500）过夜。TBST洗涤3次，加入1∶15 000稀释的荧光二抗，室温避光孵育2 h，TBST洗涤3次，通过荧光扫描仪采集信号，应用Quantity One软件分析计算灰度值。
3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，进行方差齐性检验，方差齐采用方差分析，方差不齐采用非参数检验或Welch检验。P
4 结果
4.1 丹参通络解毒汤对模型大鼠心肌组织病理形态的影响
假手术组心肌组织未见明显的病理形态改变，横纹较清晰；模型组大鼠心肌组织病理形态改变较明显，心肌组织间质炎性细胞浸润、细胞肿胀明显，部分心肌组织细胞变性、坏死，肌束排列不整齐；干细胞移植组细胞肿胀及肌束紊乱程度较模型组减轻；中药组有炎性细胞浸润，细胞肿胀轻度，肌束紊乱程度有所改善；中药+BMSCs组肌束排列较整齐，细胞肿胀轻度，炎性细胞浸润改善，细胞溶解情况减少。结果见图1。
4.2 丹参通络解毒汤对模型大鼠血清单核细胞趋化蛋白-1、可溶性细胞间黏附因子-1含量的影响
与假手术组比较，模型组大鼠血清MCP-1、sICAM-1含量明显升高（P
4.3 丹参通络解毒汤对模型大鼠心肌组织Toll样受体4蛋白表达的影响
假手术组心肌组织有少量TLR-4表达，模型组TLR-4表达明显增多（P
5 讨论
AMI后，由于组织缺血缺氧等因素激活自身病理性免疫炎症调节系统，诱导心肌组织细胞坏死、凋亡等梗死后效应，机体为了清除坏死细胞，又进一步激活炎症反应，从而导致心肌组织损伤[7]，故通过调节AMI后免疫炎症反应来减轻心肌组织缺血性损伤十分关键。AMI是一个急性炎症过程，大量实验研究表明，ICAM-1可以介导白细胞和内皮细胞的滚动和稳定黏附，并在MCP-1等炎性因子的协助下启动局部的炎症反应，AMI后MCP-1、sICAM-1呈高表达状态[8-9]。sICAM-1为ICAM-1在组织损伤后经蛋白酶裂解脱落存在于血清中的可溶性形式。TLR-4作为炎性反应的跨膜受体，可通过MyD88依赖性及非依赖性细胞信号转导途径实现NF-κB早期及晚期的活化，致使ICAM-1的表达量上调[10]，并促使MCP-1等趋化因子的合成及释放，开启炎症反应。因此，TLR-4与sICAM-1、MCP-1关系密切，都参与AMI过程。本实验结果显示，AMI后大鼠心肌组织TLR-4表达增加，而血清sICAM-1、MCP-1水平也呈现高表达状态，提示AMI可能通过TLR-4激活核因子-κB，从而诱导sICAM-1、MCP-1的表达和释放，参与AMI的病理过程。
BMSCs是一种存在于骨髓组织中具有自我增殖及能分化为心肌组织细胞、血管内皮细胞潜能的多能干细胞。无论是在动物模型研究还是临床前试验中，通过BMSCs移植治疗缺血性疾病都取得了显著的成果[11-12]。有研究显示，BMSCs不仅具有独特的免疫学特性，还能在移植后在宿主体内存活并对AMI后病理性免疫反应起到一定的调节作用。中药干预BMSCs移植可促进BMSCs的归巢、定植及分化，为BMSCs移植提供良好微环境，从而提高移植后的成活率，增强对缺血心肌组织的保护作用[13]。前期实验研究表明，疏肝活血中药可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形态和心功能[14]，益气活血方对骨髓干细胞具有动员作用[15]。
冠心病属中医学“心痛”“胸痹”“真心痛”等范畴，其发病主要是由于六犯心、七情内伤、饮食不节、年老体弱等致心脏的阴、阳、气、血亏损，痰浊、瘀血、气滞、寒凝等阻于心络。然而，外邪和内邪在机体中积聚日久，逐渐蕴积成毒，毒损心络，导致心络不通，即使心肌组织再灌注治疗血液再通，但缺血心肌组织原有代谢毒物未能排出，再灌注产生的氧自由基和炎症因子等新的“浊毒”对心体的损害又进一步加重。丹参通络解毒汤是多年临床经验方，由丹参、玄参、黄芩、水蛭、川芎等组成，方中丹参主要有效成分丹参酮和丹酚酸具有扩张冠状动脉、防止心肌组织缺血和心肌梗死、改善微循环、降低心肌组织耗氧量、抑制炎症反应等作用[16]；川芎有效成分川芎嗪可改善冠状动脉的血液循环，减轻心肌组织缺血后心肌组织细胞损伤，减少梗死面积[17]；玄参提取物降低炎症细胞因子过量表达，对心肌组织具有明显保护作用[18]；黄芩有效成分黄芩素、黄芩苷具有抗氧化、清除自由基的作用，从而修复损伤心肌组织[19]。全方具有益气活血、通络解毒的功效。本实验结果显示，该方能有效降低AMI大鼠血清sICAM-1、MCP-1含量，减少心肌组织TLR-4的表达，明显改善心肌组织病理形态，提示丹参解毒通络汤可能通过抑制TLR-4激活，减少sICAM-1、MCP-1的表达和释放，从而抑制AMI后的炎症反应，修复心肌组织损伤。并且，丹参通络解毒汤联合干细胞移植对大鼠AMI后干预作用较单纯丹参通络解毒汤和单纯干细胞移植干预作用更为显著，提示丹参通络解毒汤与BMSCs移植的联合作用，可以通过抑制TLR-4激活，增强对梗死心肌局部炎症的抑制作用，进而加强对梗死心肌的修复作用，减轻心室重构。
综上所述，丹参通络解毒汤联合干细胞移植可以抑制大鼠AMI后炎症反应，改善急性心肌组织缺血大鼠的心肌损伤，其机制可能是通过调节TLR-4介导的炎症反应实现的。
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借款合同担保书
编号：_________
保证人：_________
法定代表人：_________
地址：_________
开户银行：_________
帐户：_________
_________银行：
鉴于你行向_________(下称“借款人”)提供(币种)_________贷款(金额)_________(大写：_________)(下称“贷款”)。该借款合同(下称“合同”)编号为_________。该贷款期限为_________，利率为_________，用于_________。本保证人已了解并同意“合同”所有条款，应“借款人”要求，现本保证人同意为上述“贷款”全额担保，特此开立以你行为受益人的无条件的、不可撤销的担保书，向你行保证如下：
一、本保证人保证“借款人”全面履行“合同”。如“借款人”未能按“合同”规定偿付各期到期(包括被宣布到期)应付款项，包括本金、利息、费用、罚息、违约金和赔偿金(以下称“到期应付款项”)，不论由何原因造成，对此全部和任何“到期应付款项”，本保证人保证按下述第二条规定承担连带偿付责任和/或连带赔偿责任。
二、如果“借款人”未能按“合同”规定如数偿付上述“一期应付款项”，你行即有权直接向本保证人索偿，而无须先行向借款人追偿(/处分抵押品)，本保证人保证在收到你行第一次书面索付通知后十五天内，即无条件按通知要求将上述“借款人”的全部“到期应付款项”以“合同”规定的币种主动支付给你行，应支付额计算至本保证人实际支付日。上述索付通知书，即作为付款凭证，对本保证人具有法律约束力。
三、如果本保证人未能按前条规定期限履行上述担保责任，由此造成的延付利息和你行的其它经济损失由本保证人承担;同时，你行有权从本保证人存款帐户中扣收上述全部“到期应付款项”和延付利息。本保证人保证不提出异议和抗辩。
四、本保证人同意，今后若需追加“贷款”金额，对不超过“合同”金额_________%的追加贷款部分，按本担保书规定承担担保义务。
五、在“合同”项下全部应付款项清偿完毕之前，本保证人不能行使由于履行本保证项下义务而获得的任何代位权和索偿权。如果“借款人”向本保证人提供抵押品，非经你行书面同意，本保证人也不应行使抵押项下的权利;如果经你行同意处理抵押品，其所得全部项保证首先用于向你行偿付上述“到期应付款项”。
六、本保证人在此同意，如果发生下列任何一种或数种情况时，本担保书第一、二、三、四条规定的连带偿付责任(/连带赔偿责任)丝毫不受影响，本担保书继续有效。
1.本担保项下所有当事人变更各自的名称、地址、合资合作合同、企业章程、法定代表人、经营范围、企业性质，或借款人合并、分立、停业、撤销、解散、破产等;
2.你行延缓行使“合同”规定的权利和/或本担保项下的权利，或对“贷款”项下的还款给予任何宽限，或与“借款人”之间达成其它任何形式的和解或变通执行方式，无论是否通知本保证人;
3.“借款人”执行其上述主管部门下达的任何行政指令和规定，或“借款人”与任何单位签署任何合同、协议、契约及其它文件;本保证人上级主管部门下达的任何行政指令和规定。
七、如果全部或部分“到期应付款项”由“借款人”清偿以后，发生“借款人”破产被清盘，而根据法律规定该全部或部分清偿无效，届时，本担保书对该全部或部分“到期应付款项”继续承担本担保书规定的担保义务。
八、本保证人在此同意及确认，如你行与“借款人”修改、补充、删除“合同”条款，丝毫不影响上述第一、二、三、四条规定的担保责任和义务，但是变更“贷款”用途条款者除外。除“贷款”用途条款变更以外，“合同”中其他条款的变更无需征得本保证人同意。“合同”中与担保金额和期限有关的条款变更以后，本担保书的担保期限即自动顺延，上述担保义务不变，除非本保证人主动偿付全部“到期应付款项”;担保金额则按本担保书规定的范围及上述期限变更后的贷款利率执行，除非本保证人另有书面承诺。
九、本保证人将按你行要求定期提供有关的财务报表，并将上述第六条第1款中本保证人的变更情况及时通知你行。
十、你行可自主转让本担保项下的全部或部分权利，本担保书的受益人包括你行、你行的继承人和受让人。
十一、本保证人的继承人、人或受让人将受本担保书所有条款的约束，承担本担保项下的全部担保责任。但非经你行书面同意，本保证人不会转让任何担保义务。
十二、本担保书是连续性的担保，自开立之日起生效，直至“合同”项下全部“到期应付款项”偿清后自动失效。
十三、在执行本担保书过程中如有争议，应通过友好协商解决。经协商不能解决的，应向本担保项下受益人所在地主管法院提起诉讼。
十四、本担保书正本一式_________份，你行执_________分，本保证人和“借款人”各执一份。
保证人(公章)：_________
签发人(签字)：_________
职务：_________
根据_________________（以下简称借款人）的贷款申请和你行与借款人于_______年_______月_______日签订的贷款合同（协议或契约），你行贷给借款人人民币金额（大写）_______________贷款利率_______，贷款期限自___________至___________
在此，我_______（以下简称担保人）愿为上述合同中的借款人提供担保，并愿为之承担在合同中所有连带经济责任，特郑重声明如下：
第一条 奉担保人是经上级主管部门批准成立、工商行政管理部门发给营业执照的法人。本担保人以足够偿还本担保金额的财产作保证，保证履行本担保书所规定的义务。本担保人并在此声明，本担保书的开立已依法办妥一切必要手续，是合法的、有效的。
第二条 本担保书担保最高金额为贷款的本金人民币_______万元及该贷款的全部应付利息及费用。
第三条 本担保书为五条件不可撤销的担保文件，担保人的任何其他经济行为不改变本担保书的真实性和有效性。
第四条 担保人收到你行出具的借款人无力支付到期应付款项的证明及要求担保人履行担保责任的付款通知后，保证按付款通知规定的付款日，主动五条件向你行付清全部应付担保款项。你行出具的借款人无力支付到期应付款项的证明和要求担保人履行担保责任的付款通知是终结性的，对借款人和担保人均有约束力。
第五条 本担保书不受借款人上级单位任何指令的制约，不受借款人与任何单位签订的任何协议、文件的制约，也不受借款人破产、无力清偿借款、丧失企业资格、更改组织章程及关、停、并、转等各种变化的制约，本担保书始终有效。
只要担保的贷款本金不增加，你行对本担保贷款的合同任何修改或变通执行，均不改变担保人对贷款本息、费用偿付的担保责任。
第六条 担保人若未按你行通知期限偿款，担保人在此授权你行直接借记担保人账户，账号附后。
第七条 担保人如遇撤销、改组、破产或其他原因，失去担保资格和能力时，须提前3个月主动通知你行并推荐继承担保人，经你行确认继承担保人后，担保人协助办理担保责任转移手续。在转移担保责任未办妥前，担保人仍承担担保责任。
第八条 本担保书自签发之日起生效，至借款人或担保人偿清全部借款本息时自动失效。
第九条 本担保书解释于______________银行。
担保人（盖章）：________________
法定代表（盖章）：______________
担保人地址：____________________
第一章 总则
第一条 为规范公司的人事入职管理，特制订本规定。
第二章 试用及报到
第二条 新进人员入职资格：
1、 符合公司用人条件，并已通过面试、复试、终试者;
2、 经核查无虚假资料及经历;
3、 在原单位离职交接清楚;
4、 无传染性疾病;
5、 无犯罪记录。
第三条 员工录用前应办理报到手续，并按规定时间上班，由考勤员制卡，核定发薪日期。逾期未办理者，由备取人员依次侯补。
第四条 报到应备资料及事项：
1、 一寸彩色照片四张;
2、 社会保险卡复印件一份(已办保险者提供);
3、 身份证复印件一份及原件;
4、最高学历证原件、复印件各一份(含毕业证、学位证、英语等级证)，原件交人才交流中心验证后退回;
5、专业技术资格证明复印件一份及原件(专业人员提供)，原件与复印件核对后退回;
6、 体检证明。
第五条 公司有意向录用之人员，如为仓管、司机、送货、出纳之职务，人力部/分公司行政人事部则须先派人进行家访，了解其家庭情况，并做背景调查，将调查结果记录并存于员工个人档案。
第六条 由于工作需要，新聘员工可经人力部经理批准后先上岗，但须于5个工作日内办妥入职及担保手续，逾期未办完手续或入职资格不符合公司规定者，以自动离职处理。
第七条 新聘人员试用期为3个月，期满考核合格可转为正式员工。
第八条 员工在试用期内品行和能力欠佳不适合工作者，可随时停止使用。
第九条 员工一经录用，即签订公司所在地劳动部门正规《劳动合同书》，交劳动部门鉴证，并办理社会保险。
第三章 担保
第十条 本公司员工均应觅担保人，办理担保手续，担保人之责任均按《担保书》中的规约执行。
第十一条 本公司员工担保人应具有下列资格：
1、 担保人具有爱施德公司所在地常住户口;
2、 有正当职业及稳定经济来源;
3、 有长期稳定的住所;
4、 不能为本公司在职员工;
5、 担保人无犯罪前科。
第十二条 担保等级：
1、 一级担保：适用于仓管、司机、送货、出纳;
2、 二级担保：适用于其他人员。
第十三条 担保手续：
1、 一级担保：
A) 担保人提供户口本、身份证、房产证原件及复印件各一份(人力资源部/分公司行政人事部进行核对后将原件退回);
B) 担保人提供工作单位地址、单位电话、家庭住址、家庭电话;
C) 担保人须亲自到公司办理担保手续，并签订《担保书》。
2、 二级担保：
A) 担保人提供身份证原件及复印件各一份(人力资源部/分公司行政人事部进行核对后将原件退回);
B) 担保人提供工作单位地址、单位电话、家庭住址、家庭电话;
C) 担保人须亲自到公司办理担保手续，并签订《担保书》。
第十四条 担保人之工作单位或住址如有变更时，应由担保人或被保人以书面形式通知人力资源部办理变更。
第十五条 担保人如因故欲退保或因其他事故丧失担保资格时，应及时以书面形式通知公司人力部，由被保人另觅新担保人办妥换保手续，发还原缴担保书后方可解除原担保责任。
第十六条 本公司对员工之担保人如发现不妥时可随时通知被保人限期换保，在换保期间如有必要可暂停其职务，待换保手续办妥后才准许复职。
第十七条 本公司员工正常离职，经办妥移交手续后3个月内未发现任何弊端时发还担保书，解除担保责任。
第十八条 担保核查，核查人为公司人力部档案管理人员、分公司行政人事部指定负责人员。
1、 一级担保核查：
A) 核查担保人家庭住址和联系方式，确认是否与房产证地址相符;
B) 核查担保人工作单位、单位地址及单位电话;
C) 每半年核查一次，并作好记录。
2、 二级担保核查：
A) 核查担保人家庭电话、工作单位及单位电话;
B) 每一年核查一次，并作好记录。
第四章 背景调查
第二十条 调查等级：
1、 一级调查：适用于仓管、司机、送货、财务及经理级以上人员;
2、 二级调查：适用于业务人员、门店管理人员及保安、更夫;
3、 三级调查：适用于其他人员。
第二十一条 背景调查，调查人为公司人力部入、离职管理人员，分公司行政人事部指定负责人员，进行电话查访(根据《员工登记表》信息)。
1、 一级调查：
A) 查访内容：最近两家单位工作内容及表现、同事关系、离职原因和离职手续办理情况;家庭住址、电话等信息的真实性。
B) 查访对象：原单位人力资源部、直接上司、相关人员。
2、 二级调查：
A) 查访内容：最近一、二家单位工作内容及表现、同事关系、离职原因和离职手续办理情况;家庭住址、电话等信息的真实性。
B) 查访对象：原单位人力资源部、直接上司。
3、 三级调查：进行电话抽查单位及家庭信息。
第五章 临时员工入职管理
第二十二条 各部门、分公司有临时性工作，需雇用临时人员从事，应填《人力需求申请》，注明工作内容，期间呈部门经理及分公司负责人批核，人力部核准后招募。
第二十三条 雇用限制：
1、 年未满16岁者，不得雇用;
2、 经管财、物、仓储等主要工作不得雇用;
3、 雇用期不超过3个月(钟点工不在此限)。
第二十四条 办理入职报到手续，可视岗位情况确定入职所需资料及办理三级担保，签订《担保书》。
第六章 分公司入职资料上报
第二十五条 分公司行政人事部必须在三日内将新聘员工之《员工登记表》传真至人力资源部备案及核薪。
第二十六条 录用审批权限：
1、 分公司财务、仓管、主管级以上人员报分公司负责人审核、总公司相关部门及人力部会签，总经理核准;
2、 分公司其他员工报分公司负责人核准，人力部备案。
第二十七条 员工档案须严格按照规定顺序装订，不得随意涂改，并妥善保存，装订顺序为：
1、《员工登记表》 2、学历证复印件 3、英语等级证复印件
4、资格证书复印件 5、社保卡复印件 6、体检证明
7、《招募面试表》 8、《担保书》 9、担保人之户口本复印件
10、担保人之单位证明11、担保人房产证复印件 12、《背景调查表》
13、《家访调查表》 14、《担保核查表》
第二十八条 《员工登记表》须明确注明起薪日期、所在部门、职位及负责区域等相关事项。
第二十九条 分公司行政人事部于每月25日将本月新聘员工个人档案原件及担保资料复印件(员工个人档案复印件、《担保书》及相关担保资料原件留存分公司妥善管理)按顺序装订，以EMS方式寄至人力资源部档案管理人员。
第七章 附则
第三十条 本入职管理规定自 年 月 日起执行，同时启用新表格，旧表格一概作废。
附：1、《录用通知书》
2、《员工登记表》
3、《背景调查表》
4、《家访调查表》
5、《担保核查表》
6、《担 保 书》
附件一：
录用通知书
先生/小姐：
一、由于您的品德、学识、能力出众，已被我公司录取，热忱欢迎您加入爱施德公司的行列，成为我们良好的工作伙伴。
二、请于 年 月 日 时间携带本通知单及下列各项资料到人力资源部办理报到手续，如不能按时报到，请事先与我们联络，否则逾时将由备取人员依次候补。
三、报到应备资料及事项：
1、一寸彩色照片四张(如有社会保险卡，则只需交2张照片)。
2、社会保险卡复印件一份(已办保险者提供)。
3、身份证复印件一份及原件。
4、最高学历证原件及复印件各一份(含毕业证、学位证、英语等级证)由
公司交人才交流中心验证后退回本人。
5、专业技术资格证明复印件一份及原件(专业人员提供)。
6、体检证明(公司指定的医院)。
7、 办理担保手续，请有固定工作并有爱施德公司所在地常住户口之担保人带身份证、户口本原件及复印件各一份(人力资源部/分公司行政人事部进行核对后将原件退回)亲自到公司签署担保书(注：担保人提供资料经查核不实者将被辞退)。
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