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关键词 非煤矿山安全标准化 存在问题 分析 建议
中图分类号：TD79 文献标识码：A
非煤矿山安全标准化建设是矿山企业一项重要的基础管理工作，具有动态性、长效性。早在80年代初期，全国地方煤炭系统在本行业主管部门的监督下推行了煤矿标准化建设工作，取得了一定的成绩，全国范围内地方煤炭企业事故率明显下降，这说明标准化建设对保障煤炭安全生产起到了一定的作用，至今煤炭行业标准建设工作为省级以上煤炭安全监督检查部门准入企业从事生产条件之一，由此可见开展标准化建设的重要意义。近些年随着我国非煤矿山上的迅速发展，相对的矿山安全事故也在不断上升，尽管国家出台了一系列的控制治理措施，得到了明显的改善，但随着非煤矿山的快速发展，非标准生产和无序开采导致的安全事故频出不断。直到2006年11月国家出台了金属非金属矿山安全标准化规范，从而非煤矿山企业进入安全标准管理轨道上来。但矿山企业安全标准化建设和各级安监部门监督体制仍然跟不上发展的需求，国务院在2010年出台23号文件，指出在规定时间内必须实现达标，没有达标的暂扣两证和整改，整改后仍然未达标的建议地方政府关闭。2011年国家安监总局出台104号文件，提出标准化建设思路和目标，到2013年底前所有非煤矿山达到三级标准化水平，2015年底前大中型非煤矿山达到二级标准化水平。由此可见国家把安全标准化建设工作提高到重要程度来抓。笔者参加本地区多家金属非金属矿山标准化验收工作，现就矿山标准化建设软件、硬件两个方面存在的问题进行分析并提出改进措施。
1标准化建设软件方面
软件资料是看得见摸得着的有形纸质版东西，是标准化建设活动一系列内容的记载，又是安全生产活动指导、反馈和保障性资料，包含企业相关规章制度、规程、各类表单等。
1.1存在的问题
（1）内容文题不符，未进行深度分解。主要体现在内容脱离实际，缺少手段和措施。如第一元素安全生方针执行“是否有由最高管理者签发的文件化的安全生产方针？”对这一问题缺乏必要的理解，首先最“高管理者签发”“文件化”，很多矿山最高管理者签发了但没有形成文件，有的形成文件但最高管理者没有签发。再比如安全目标，有的矿山比较单一，只规定无重伤、零死亡目标，缺少培训、设备实施、隐患整改、职业健康等目标。还有的矿山目标不明确，没有量化。
（2）缺乏系统资料管理。文件资料未进行分类、无编号、无日期、无保存归档单位、无定期更新等。程序文件、作业指导书陈旧，与实际已经不相符，缺乏收回报废更新。
（3）资质单位评审报告提交后，未进行问题的持续改进。有的矿山进行完标准化评审就算告一段落，对评审过程中提出的问题没有进一步制定措施。
1.2解决措施
标准化14个元素分为若干子元素，每个子元素又有很多问题，软件应当从每个问题中逆行对应进行建立。同时深刻理解每个问题所涵盖的内容意义，根据内容意义建立健全与其相对应的管理资料。如第五个元员工教育培训，要建立培训计划、培训记录、培训大纲、培训内容、学时保障一整套文件。同时不能局限于一般的三级培训，对法律法规、应急逃生、风险识别、事故报告也进行培训。
建立标准化持续改进制度并予以跟踪。
2标准化建设硬件方面
矿山硬件是对设计、规程的具体体现，是设计与规程的有机结合。标准化硬件建设涉及内容广泛，其验收标准主要依据安全规程，是对安全规程条款的详细分解。对具体实际而言主要体现在作业现场、设备实施、生产工艺、风险管理、应急管理、安全投入、检查等方面。
2.1存在的问题
（1）作业现场方面，主要体现标志、标识、警示不清楚，未注明应对各类灾害的逃生办法和路线，作业现场距安全出口距离没标出。
（2）设备实施方面，保护不全、缺少防护、隔离等设施，淘汰设备不能及时更新，新设备在使用时没有风险管理。尤其地下矿山缺少有效的通风设施，通风系统段短路，多数靠自然通风，局部积存污浊空气。
（3）生产工艺落后，与规程及设计存在差异，应急变化、处理突发事件管理未及时更新，没有针对性的培训教育，作业规程不符合实际。
（4）风险管理方面主要是有一定的局限性，对本矿山在用关键设备和作业过程中存在的风险进行评价，对周边环境和已经采过的空区存在危险否不清楚，缺乏检测评价。
（5）应急管理面窄，没有全面展开，很多矿山注重于火灾、水灾的演练，缺乏诸如竖井坠罐、井下窒息、地压灾害等演练。有的矿山进行桌面演练，员工理解不深，缺乏实际能力。有的演练没有专职救护队和社会政府结构参加，实效不能印证。
（6）安全投入不足，财务未建立投入台账，安全费没有使用记录。
（7）检查内容不明确，检查周期和线路不清，例行检查与巡回检查没有分开，专项检查、综合检查层次混淆。
（8）职业卫生管理方面，现场缺乏足够的卫生应急箱和应急措施，员工在上岗、离岗、换岗没有进行体检或体检人数不足，对体检资料缺乏分析。
2.2解决措施
矿山标准化硬件管理是一个动态性，但在一定时期内会保持相对稳定，矿山与矿山之间存在差异。同一个矿山在不同时间阶段又存在差异，而且随着矿山的开采，差异性越来越明显，要想解决标准化硬件存在的问题需要从以下入手：
（1）提高对安全标准化的认识，是解决矿山标准化硬件途径之一，只有认识到位，思想才能到位，思想到位，行动才能到位。
（2）注重标准化建设中的资金投入，只有足额资金投入及时到位，才能解决标准化建设中的一些硬件设施。
（3）加大培训和宣传力度，标准化建设不是一个人的事情，是全员参与，只有全员参与，提高整体素质，标准化工作才能做得更好。
（4）不断寻求创新提高标准化水平。创新包括技术创新、管理创新、知识创新。
3结论
矿山安全标准化建设是矿山企业推动安全发展，提高安全保障，创造社会和谐的基础管理工作，也是矿山企业加强技术管理提高经济效益的主要途径，正确认识和分析矿山企业开展安全标准化建设的重要意义，找出标准化建设过程中存在的不足，做到持续改进，从而更好地实现安全生产，为社会创造效益。
参考文献
【摘要】2011 年以来我国内部控制审计报告出具的数量逐年递增，与此同时，非标准的内部控制审计意见报告所占比例也有所上升。本文选取了2013 年度内部控制审计报告以及财务报表审计报告均为非标准意见的代表企业华锐风电，以及内部控制审计报告为非标准意见但财务报表审计报告为标准无保留意见的代表企业上海家化进行案例分析。对非标准内部控制审计意见与财务报表审计意见之间的关系进行了研究。
【关键词】审计意见 审计报告 内部控制审计 财务报表审计
一、引言
2007 年，美国公众公司会计监督委员会公开了第5 号审计准则，《与财务报表审计整合的财务报表内部控制审计》，准则规定了内部控制审计程序以及内部控制的方法，准则还表示要尽量在导致财务报表发生重大错报之前找出内部控制的重大缺陷。2008 年，财政部、审计署、证监会、银监会等联合了《企业内部控制基本规范》，该规范要求在深市和沪市上市的公司应对本公司的内部控制有效性进行自我评价，并且公开披露企业年度的内部控制自我评价报告，在进行审计业务时，需聘请具有专业资质的会计师事务所来进行企业内部控制有效性的审计活动。2014 年，财政部联合证监会了《公开发行证券的公司信息披露编报规则第21 号——年度内部控制评价报告的一般规定》，明确了内部控制评价报告构成要素，需要披露的主要内容及相关要求。
被出具非标准财务报表审计意见的上市公司数量自2011 年以来逐年递减，且所占百分比也在逐年降低，然而被出具非标准内部控制审计意见类型的上市公司数量自2011 年以来却逐年增加，且所占百分比也逐年增加。本文选取了2013 年度内部控制审计报告以及财务报表审计报告均为非标准意见的代表企业华锐风电，以及内部控制审计报告为非标准意见但财务报表审计报告为标准无保留意见的代表企业上海家化进行案例分析，旨在探究内部控制审计意见对财务报表审计意见的影响。
二、内部控制审计报告与财务报表审计报告披露现状分析
（一）2011—2013 年上市公司财务报表审计报告意见汇总
中国注册会计师协会公布数据，截止2014 年4月30 日，共有40 家证券资格的会计师事务所为来自深市与沪市的2 534 家上市公司出具了2013 年年度财务报表审计报告，在这些财务报表审计报告中，包含有2 450 份标准无保留的审计意见，57 份带强调事项段的无保留意见，22 份保留意见，以及5 份无法表示意见的审计报告。见表（1）。
与此同时，截至2014 年4 月30 日，共有40 证券资格的会计师事务所为来自深市与沪市的1 141家上市公司出具了2013 年年度内部控制审计报告。在这一千多份的内部控制审计报告中，有1 096 份是标准无保留意见内部控制审计报告，35 份是带强调事项段的无保留意见，9 份否定意见，以及1 份无法表示意见的内部控制审计报告。见表（2）。
（二）2011—2013 年上市公司内部控制审计报告意见汇总
（三）2011—2013 年被出具非标准内部控制审计报告的上市公司财务报表审计意见汇总
同时被出具非标准财务报表审计意见和非标准内部控制审计意见的上市公司2011 年没有，2012年只有6 家，在2013 年却达到了21 家。
（四）非标内部控制审计报告增加原因分析
（1）内部控制缺陷造成影响逐渐增大。近年来内部控制的相关法规细则不断颁布出来，从框架结构到具体内容不断细化。尤其是在2014 年最新的《公开发行证券的公司信息披露编报规则第21号——年度内部控制评价报告的一般规定》，明确了内部控制评价报告构成要素，说明了需披露的内容及要求，并且还提供了可供注册会计师参考的内部控制审计报告模板。因此，内部控制评价向着更加规范化、标准化的方向发展。
（2）审计意见的客观性进一步提高。注册会计师在内部控制审计方面的专业性越来越高，经验越来越丰富，同时职业道德也有所提高，敢于披露被审计单位内部控制的缺陷。
（3）企业内部控制重视程度提高。认识到内部控制对于企业发展的重要性，积极接受注册会计师出具的内部控制审计意见，并在内部控制自我评价报告中披露，提出解决问题的可行性计划和方案。
三、内部审计报告与财务报表审计报表案例分析
（一）案例背景
华锐风电科技股份有限公司是一家以风电为主的新能源企业，主要进行不同风电机组的研发、制造和销售。华锐风电公司在2013 年度被同时出具了非标准的内部控制审计报告和财务报表审计报告。其中，内部控制审计意见为否定意见，财务报表审计意见为保留意见。上海家化联合股份有限公司是我国化妆品行业中第一家上市企业，产品覆盖化妆品、家居护理用品等，拥有国际水准研发以及广大的消费市场。上海家化2013 年年度审计报告中，内部控制审计意见为否定意见，但财务报表审计意见却为标准无保留意见。
（二）案例分析
1. 华锐风电
（1）华锐风电公司未能对实物资产实行有效控制，在对2013 年年末的存货进行了全面清查后，发现了账实不符的情况，实物相比较账面金额，存在126 853.54 万元的短缺。由于公司对于存货盘点结果尚未核对完成，因此，在尚未获得充分、适当的审计证据的情况下，注册会计师无法实施必要审计程序，从而对于盘点结果以及由此所影响的存货、资产减值损失、管理费用等会计科目无法确认。并且在对应付账款进行函证时，发现了较多往来不符的情形，在该情形下注册会计师认为无法实施替代程序以获取充分、适当的审计证据。
（2）华锐风电公司2013 年年末在其母公司财务报表上确认了递延所得税资产32 924.13 万元。但在此之前华锐风电已连续两年出现亏损。其中母公司在 2012 年与2013 年分别取得利润总额为-71 011.26万元和-331 244.50 万元。因对华锐风电公司未来的盈利情况不确定，注册会计师认为无法确定这一事项对公司财务报表的影响是否恰当。
（3）华锐风电公司于2013 年 5 月、 以及2014年 1 月分别收到来自中国证监会的两封《立案调查通知书》，证监会决定开始对华锐风电公司进行立案调查。截至到审计报告签发日，证监会的相关调查工作仍未结束，因此，注册会计师无法判断调查结论可能对华锐风电公司财务报表产生的影响。
2. 上海家化
（1）由于上海家化并没有披露与吴江市黎里沪江日用化学品厂的关联交易事项，并且于2013 年11 月收到了来自中国证监会的《行政监管措施决定书》，认定上海家化在2009 年至2013 年与沪江日化发生的关联交易违反了相关的法律法规。注册会计师认为，上海家化对关联交易未能进行有效控制，并且由于关联方交易的未能及时识别会影响财务报表中与关联方有关的数据的完整性以及准确性，导致内部控制设计的失效。虽然上海家化在2013 年12 月表示对上述缺陷已进行了整改，但因为运行时间不长，因此不能认定整改有效。
（2）注册会计师认为上海家化在2013 年以前及之后与代加工厂发生的委托加工交易在会计处理方法上不一致，由此认定部分上海家化子公司并未建立销售返利以及运输费等有关的内部控制。这一缺陷会导致财务报表中涉及销售费用和运输费用等相关交易的完整性、准确性以及截止性产生偏差，因此认定相关内部控制设计失效。
（3）注册会计师发现在2013 年12 月31 日的财务报表中，财务人员将本应计入其他应付款科目的费用计入了应付账款科目，影响到财务报表多个会计科目的准确性，因此认为上海家化的财务人员的专业素养不够，造成会计处理的差错。注册会计师说明在2013 年年度财务报表审计中，已经考虑了上述重大缺陷对审计程序的性质、时间安排和范围的影响。因此，否定的内控审计意见并未对上海家化2013 年年度财务报表出具的审计报告意见产生影响。然而在华锐风电内部控制审计报告中看出，由于对存货等实物资产缺乏有效的内部控制，导致了财务报表审计报告中保留意见事项一、二对资产负债表中的“存货”“应收账款”“资产减值损失”“管理费用”“销售费用”等会计科目产生重大影响，这些重大缺陷都是属于财务报表层次产生的。因此可以看出，内部控制审计意见与财务报表审计意见关系紧密，内部控制财务报表层次的缺陷会对财务报表审计报告意见产生重大影响。
四、结论
华锐风电公司与上海家化公司2013 年度的内部控制审计报告均被出具了否定的意见，华锐风电被出具的财务报表审计报告是保留意见，上海家化被出具的财务报表审计报告却是标准无保留意见。本文分析，只有当内部控制出现财务报表层次缺陷时，才会对财务报表产生影响，从而引发财务报表审计非标准审计意见的出现。在关注非标准的内部控制审计意见时，应注意报告中所涉及的缺陷是否为财务报表层次的缺陷，如果是则对财务报表审计意见影响大；如果否则对财务报表审计意见影响较小。另外，即使企业当年被出具了非标准的内部控制审计意见，并且内部控制缺陷为非财务报表层次，但由于其所具有的滞后性，仍然有可能会影响到以后年度的财务报表审计报告的意见。
参考文献
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一、关于“文化”、“城市文化”、“非物质文化遗产”内涵的引入
关于“文化”概念与范畴的界定一直是学界热衷探讨和研究的主题。近代最早对“文化”一词作出明确定义的是英国著名人类学家泰勒（E. B. Tylor），他在1871年出版的《原始文化》一书中提出：“所谓文化或文明，是知识、信仰、艺术、道德、法律、习俗以及包括作为社会成员的个人而获得其他任何能力、习惯在内的一种综合体。”[1]美国学者克罗伯（A. L. Kroeber）和克拉克洪（D. Kluckhohn）在1952年发表的《文化：一个概念定义的考评》（Culture： A Critical Review of Concepts and Definitions）中，对164条关于文化的定义进行了分析考察，并对文化下了一个综合定义：“文化存在于各种内隐和外显的模式之中，借助符号的运用得以学习与传播，并构成人类群体的特殊成就，这些成就包括他们制造物品的各种具体式样，文化的基本要素是传统（通过历史衍生和由选择得到的）思想观念和价值，其中尤以价值观最为重要。”[2]无论是泰勒的先行尝试还是克罗伯和克拉克洪的归纳概括似乎都不能穷尽“文化”给我们带来的认识体验和空间想象。拉尔夫・林顿（Ralph Linton）则认为“文化”就是任何社会的全部生活方式。[3]由于“文化”自身话语空间内部的不确定性和边界的宏观性，所以在其概念和范畴没有统一界定的情况下，学者们采取的研究对策往往是在“文化”概念前加个前缀框定论述的范围和细化研究的对象，又或者是避开对“文化”本体学理的纠缠而直接探讨其宏观共性的特质与作用。
城市作为“文化”的一种空间呈现进入到我们的视野，对城市文化的研究实质上就是对人的生存方式与现实境遇的反思与探索。鉴于国内外对城市文化的研究成果，本人曾以文化软实力的视角，从可操作的微观层面提出从文化价值吸引力、文化产业竞争力、文化知识生产力和文化w制引导力四个方面去构建我们的城市文化。《大英百科全书》将城市文化概括为“各种类型的城市或者城区的所有行为模式，这些模式既可以是过去的，也可以是现在发生的”。[4]该论述虽然对城市文化没有作出明确的概念定义，但指出了城市文化至少包涵了文化遗产（culture heritage）、文化实践（culture practice）和文化表述（culture expression）三层内容。其中，文化遗产分为两大范畴，物质文化遗产主要指传统历史文化街区、文物建筑、景观遗址等，非物质文化遗产（非遗）指被各群体、团体（有时是个人）视为其文化遗产的各种实践、表演、表现形式、知识和技能及其有关的工具、实物、工艺品和文化场所。文化实践是指发生在城市空间里的一系列行为活动，包括个体实践和公共参与。文化表述则体现在文化生产与消费过程中个体和社会的表达形式与情感意愿。在城市文化建构中，无论是文化价值、文化产业、文化知识和文化体制四个方面，还是文化遗产、文化实践和文化表述三个层面，它们都不是泾渭分明，而是彼此关联、互相影响。其中，非遗之于城市文化的表征功能值得我们深入研究。
人类存在的方式与生存需求推动了城市的发展进程，而非遗也随着这发展进程不断地演变与存留，它承载了人类对于存在和未知的敬畏，呈现了人类的本质属性，见证了人类智慧的积累，记录了时空对城市演变的作用和文化意义。因此，非遗是人类在过去与现在的双时空下对生命存在方式的一种认同与延续，是城市作为人类活动空间与生存媒介得以彼此区分的根源。探讨非遗表征城市文化的发生机制可助我们追根溯源，进一步地阐释与丰富城市文化的意义生产、价值认同与审美观照。同时，从非遗的表征功能反思探讨如何才能对其进行有效保护和活态传承。
二、社会记忆
记忆对于人类而言，不是简单的对过往事物的再现或临摹，它看似重复，其实充斥了对过往的反思和当下的权衡。记忆促使群体意识内在强化，但也使得群体内外历时性特质和群体内外共时性特质互相渗透与交融成为可能。不同的群体构成不同的社会记忆，而社会记忆会在有限的城市空间内进行意义生产，最后形成该空间特有的文化底蕴。
【关键词】水飞蓟素；肾小管间质纤维化；转化生长因子-β1 肾小管间质纤维化（renal tubulointerstitial fibrosis，TIF）几乎是所有慢性肾脏疾病发展的最终结局，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一[1]。这个过程受许多因素影响，其发展机制涉及许多方面。近年来研究表明转化生长因子-β1（TGF-β1）在TIF进程中具有重要的促进作用[2]。本文旨在探讨应用水飞蓟素延缓肾小管间质纤维化可能机制。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 动物模型及分组 选用3月龄SD大鼠56只，体重200～250 g，随机分为：梗阻组（24只）、治疗组（24只）、假手术组（8只）。大鼠行氯胺酮50 mg/kg麻醉，取左旁正中切口剪开腹壁，以4号手术线将左输尿管近端两处结扎。假手术组同样处理但不结扎。其中于术前30 min治疗组开始给予水飞蓟素30 mg/kg灌胃，1次/d；假手术组和梗阻组给予等量生理盐水灌胃处理。UUO大鼠于术后第7天、14 d、21 d随机收获8只，假手术组于第21天一次处死。取肾脏，10%多聚甲醛固定。免疫组织化学法检测肾脏TGF-β1的表达情况和RT-PCR法检测各组肾组织TGF-β1mRNA表达水平。实验过程中梗阻组第14天、21 d时间点各死亡大鼠1只。
1.2 免疫组化 采用SABC法检测肾组织中的TGF-β1，操作步骤按SABC试剂盒说明书进行。高倍镜（×200）下在每张不包含肾小球和血管的肾小管间质区域随机选取10个不重叠的视野，应用IDA-2000高清晰度数码图像分析系统进行图像采集，经灰度变换将阳性染色区域面积与该视野总面积百分比，计算平均值作为该样本的百分比值。
1.3 RT-PCR PCR 引物合成：上海申工生物工程公司。引物序列及产物如下。
作者单位：453000 新乡市中心医院儿一科（王成祥）；新乡医学院第一附属
医院儿二科（韩子明） 采用凝胶成像摄片及分析 用琼脂糖凝胶电泳图像分析系统（SYNGENE公司）在紫外光下采集图像并分析，分析时TGF-β1与β-actin扩增条带的吸光度值比值作为各指标mRNA相对表达水平。
1.5 统计学方法 各组数据均采用均数±标准差（x±s）表达，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验法。由SPSS11.5统计软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 肾组织免疫组化变化 假手术组肾组织微量表达TGF-β1，主要位于肾小球系膜和上皮细胞，小管主要表达于远曲小管；梗阻组和治疗组肾组织表达TGF-β1逐渐增强，遍布皮髄质损伤的肾小管，除肾小管上皮细胞有阳性表达外，增殖的单核巨噬细胞TGF-β1亦有表达。各观察时间点治疗组较梗阻组减少（P
2.2 RT-PCR结果 假手术组大鼠肾脏存在少量TGF-β1mRNA表达。UUO大鼠各组随着病情进展，肾组织表达TGF-β1mRNA逐渐增强，高峰持续至21 d实验结束。治疗组肾脏组织表达TGF-β较梗阻组减少（P均
3 讨论
水飞蓟素是从水飞蓟植物提取的混合物，是一种黄酮醇类化合物，主要含水飞蓟宾、水飞蓟宁、水飞蓟醇等。水飞蓟素作为一种传统药物曾广泛用于防治肝脏纤维化。它主要通过下调TGF-β1在肝内的表达，改变肝枯否细胞的功能，抑制炎症反应，有效阻止肝纤维化[3]。韩子明等[4]应用水飞蓟素治疗大鼠肾小管间质纤维化，明显延缓了肾小管间质纤维化。TGF-β1表达增加与肾间质纤维化关系密切。本实验研究结果显示：梗阻组、治疗组肾组织表达TGF-β1逐渐增强，遍布皮髄质损伤的肾小管，除肾小管上皮细胞有阳性表达外，增殖的单核巨噬细胞TGF-β1亦有表达。RT-PCR结果显示TGF-β1mRNA与蛋白表达水平在UUO大鼠术侧肾脏渐进性增加的情况，反映了相似的分布变化规律。这与文献报道相一致。经水飞蓟素治疗的治疗组肾脏组织各观察时间点TGF-β1mRNA与蛋白表达均较梗阻组减少（P
参 考 文 献
[1] Li M.X， Liu B.C. Epithelial to mesenchymal transition in the progression of tubulointerstitial fibrosis. Chinese Medical Journal，2007， 120， 1925–1930.
[2] Wynn TA. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. J Pathol.2008，214：199-210.
关键词：商业银行;银行间市场;非标准化债权资产;银行监管
中图分类号：F830 文献标识码：A 文章编号：1003-9031（2016）01-0044-06 DOI：10.3969/j.issn.1003-9031.2016.01.08
一、引言
非标准化债权资产（简称非标资产）指“未在银行间市场及证券交易所市场交易的债权性资产，包括但不限于信贷资产、信托贷款、委托债券、承兑汇票、信用证、应收账款、各类受（收）益权、带回购条款的股权类融资等[1]。”从内涵上看，非标资产基本涵盖了商业银行资产业务模式，其中的信贷资产和承兑汇票是商业银行贷款业务的重要组成部分，同时也是银行监管的核心。目前，除传统正规方式外，商业银行进行非标资产业务（尤其是信贷资产和承兑汇票）主要有两种渠道――银行理财及银行间市场，而且以这两种方式交易的非标资产规模迅速膨胀。银监会于2013年将“非标资产”重新定义和界定则是对当前商业银行持续金融“创新”导致监管环境复杂的结果。本文分析商业银行通过银行间市场进行非标资产业务的形式、规模以及风险，并以此得出结论，为银行监管提供借鉴。
二、银行间市场发展及资金融通情况
（一）我国银行间市场的定位
自1984年我国建立银行间市场以来，经过不断的调整和完善，银行间市场已经成为金融机构之间解决流动性不足而进行短期融资的场所，并且交易规模呈逐年上升趋势。当前银行间市场主要包括两部分：一是完全以信用为基础的资金融通市场，二是以金融工具为标的的交易市场。前者是银行同业拆借市场，后者则主要由票据市场、债券市场及相关衍生品市场组成。同业拆借期限较短，一般不会超过一年，最常见的是隔夜拆借。在以金融工具为标的的市场中，票据与债券回购一直是商业银行频繁使用的资金融通方式。正回购方作为债务人将交易计入“卖出回购”，逆回购方作为债权人将交易计入“买入返售”。在银行间市场中，传统的回购对象不仅包括票据和债券，还包括贷款，而且在2012年之前债券是银行回购的主要金融工具。但从2012年开始，很多银行为了规避监管，在具体操作中又幻化出多种交易手段，这一点在票据的使用上尤为明显[2]。
（二）银行间市场资金融通情况
自2007年美国次贷危机以来，各国监管部门以及国际监管机构都加强了本国银行业监管及跨区域银行监管合作的力度。新的法规和措施仍然围绕银行监管的两大传统领域――资本充足率和流动性展开，并提出更高的要求。在资本充足率管理方面，巴塞尔委员会于2010年通过《巴塞尔协议III》。根据新协议，国务院规定我国将执行商业银行资本充足率新标准：系统重要性银行最低资本充足率要求为11.5%，非系统重要性银行为10.5%。在流动性监管方面，我国银监会对当前流动性风险进行评估，并根据2013年公布的《第三版巴塞尔协议：流动性覆盖率和流动性风险监测标准》，制定《商业银行流动性风险管理办法（试行）》，规定了存贷比、流动性比例及流动性覆盖率三项流动性风险监管指标。除此之外，2013年7月5日，国务院下发《关于金融支持经济结构调整和转型升级的指导意见》（简称金十条）。其中在加强金融风险防范方面，要求银行控制地方政府融资平台、房地产以及“两高一剩”行业等当前重点金融风险领域的贷款规模。
总的来说，风险监管对商业银行高杠杆经营模式进行了各种限定。但从商业银行角度，这些监管恰恰成为其进行“创新”，绕道监管的激励。“创新”手段之一便是通过银行间市场发展非标资产业务，将受到多重监管的贷款业务转化成监管相对宽松的银行间市场业务。这直接导致了银行间市场交易异常活跃，交易量大增的局面[3]。作为金融机构资金融通的传统手段，同业拆借交易量自2010年起便出现波动上涨趋势（如图1所示），2009年全年同业拆借交易总量为19.35万亿元，仅在2015年上半年交易量已高达24.48万亿元。回购市场交易量呈稳步上涨趋势（如图2所示），2009年全年回购交易成交额为67.7万亿元，2015年上半年回购交易成交额已高达164.68万亿元。
银行间市场交易规模的巨变反映出商业银行在资金来源以及资金使用方式上本质性的转变。这种转变体现了银行正采用灵活的手段，利用银行间市场的短期交易将非标资产进行表内转移，而“创新”背后则隐含巨大的系统性风险。
三、商业银行“非标资产”业务运营模式――以银行间市场为平台
（一）商业银行银行间市场非标资产交易情况
商业银行通过银行间市场进行非标资产业务有直接购买和买入返售两种运作模式。直接购买非标资产是指银行通过同业资金，购买其他金融机构发行的附有受益权的金融资产，从而达到间接发放贷款的目的。在此过程中形成的资产不计入贷款，而是转化为投资项，使用最多的是应收款项投资。这种运作方式出现较早，2012年前最初被几家上市商业银行采用，而在2012年该模式已经成为商业银行广泛使用的银行间市场非标资产业务手段。如图3所示，自2009年以来，上市商业银行应收款项类投资中的非标资产持续增加。其中虽然经历两次波动，但交易量短时间内反弹强烈。与2009年全年的1233亿元非标资产存量相比，上市商业银行2015年上半年通过该业务转移的资产已高达61199亿元。
买入返售非标资产是指商业银行通过回购交易，将选定或已形成贷款的融资项目转化为短期同业资产，主要包括买入返售信托受益权和买入返售票据。商业银行大规模使用买入返售信托受益权始于2012年。2013年中期出现的“钱荒”事件以及2014年年底央行及银监会对银行间市场的一系列监管，使该业务逐渐被其他业务模式取代。买入返售票据在很多商业银行的非标资产业务中占重要地位。该业务大规模发展始于2010年，2013年上半年交易量高达28112亿元，是2009年的3倍。同样源于“钱荒”事件和监管，商业银行对该类交易不断进行调整，使资产存量出现剧烈波动，但基本维持在较高水平（见图3）。
（二）直接购买附有受益权的非标资产
商业银行通过同业拆借资金购买其他商业银行、信托机构、证券公司等金融机构发行的金融工具（主要是理财产品、信托受益权或资产管理计划），可以将本行贷款转变为投资项目。运行模式如图4所示：
银行A首先选定贷款项目，但直接放贷会受到贷款投向、资本金以及流动性等各方面制约，因此商业银行可以选择其他银行、信托公司等金融机构作为“过桥”公司，通过购买其发行的各种附有受益权的非标金融资产，达到间接放款的目的。在此过程中，银行A购买的非标资产并不计入“客户贷款及垫款”，而是转化为投资项目。各家银行的转移科目并不相同，主要是在“应收款项类投资”项下种类繁多的二级科目，如“受益权转让计划”、“资金信托及资产管理计划”、“其他金融机构发行的理财产品”等。投资类别选取上，商业银行偏重于信托受益权及资产管理计划。除应收款项类投资外，个别银行还计入在“可供出售金融资产”。
（三）买入返售非标资产
1.买入返售信托受益权
最先开始进行买入返售信托受益权的是兴业银行。2010年该行买入返售金融资产达14亿元。银行大规模进行信托受益权买入返售是2012年下半年。运作模式如图5所示：
银行A有一贷款项目，但因贷款资金紧张或受贷款投向等方面的监管限制，无法直接进行投资。为了维护客户关系，首先银行A委托信托公司成立信托受益权并对其进行担保，同时由银行B认购（计入投资项目，规避监管）。由于该受益权是长期投资，对银行B来说会占用资金，因此银行B通过与银行C进行短期回购交易将资金进行回笼。在回购到期时，银行B与银行C进行结算，同时寻找另一家银行D接盘。如此反复进行，直至受益权到期。在此过程中，银行B以及信托公司起过桥作用，收取过桥费。
2.买入返售票据
票据常用于贸易结算。当企业贸易背景得到银行认可后，支付20～100%的保证金，银行便为票据签署付款承诺，即为银行承兑汇票。当银行签署承兑汇票时，该业务属于表外业务，并不计入贷款规模。但当持票人在票据到期前向银行办理贴现，就要视同贷款计入表内的“客户贷款和垫款”，并接受各项监管。为规避监管，银行A采用“卖断+买入返售”的做法，即银行A将已贴现的银行承兑汇票卖断给银行B。由于该交易会占用银行B的资金，因此两家银行会进行附带买断条款的票据回购交易，即银行A先将已卖出的票据进行买入返售，将贷款进行转化。当票据快到期时，两家银行在办理回购结算的同时，银行A对其进行买断。
商业银行频繁使用票据的买入返售，从银行资产负债表中表现为银行间市场交易量暴涨，这在中小商业银行中表现尤为明显。很多城市商业银行也将其作为资产扩充的手段。如苏州银行2009年银行间市场交易资产占总资产的比例为8%，2013年年末则高达30.8%，相应的资产规模增加了近5倍。2014年，买入返售资产大量减少，而应收款项类投资剧烈反弹，资产规模已扩张到2009年的6倍。北部湾银行2009年银行间市场交易资产占比22.4%，2012年达到39.4%，直到2013年才恢复正常水平，此时资产规模已经是2009年的4.5倍。城市商业银行之所以频繁使用银行间交易，是因为大部分银行都有上市计划，而通过正常渠道达到银行上市资产规模要求比较困难。鉴于此，很多城市商业银行利用银行间资金流转使资产负债表对应项目账面价值快速累积，非常便捷的达到上市要求。如采用“票据对敲”，A银行买入B银行的票据，B银行承诺在一定期限后回购。与此同时，B银行买入A银行相同金额的票据，A银行承诺相同期限后回购，交易后两家银行资产规模都得到提升。
四、银行间市场“非标资产”业务风险及效率分析
（一）增加银行系统流动性风险
商业银行通过银行间市场进行非标资产业务的后果之一是会增加整个系统的流动性不足。银行间市场业务一般来说是短期交易，而非标资产业务没有二级市场，其中的信托受益权是长期投资，因此存在将筹措的短期资金投资于缺乏流动性的长期金融工具的现象[4]。严重的“期限错配”问题需要银行在流动性负债到期前不断地募集资金支持长期项目。从表面上看似乎增加了资金的流动，却导致整个系统对短期资金的饥渴，增加了流动性风险。除了银行间市场的非标资产业务以外，理财、券商定向资管形成的大量表外业务随时都需要资金衔接，一旦出现整体流动性紧张，就会出现恐慌情绪，银行间市场利率也会飙升，加剧资金短缺。同时，大量短期资金在金融体系内频繁循环，使同业之间相互牵扯密切，一个环节生变就会引发连锁反应，加剧风险的积累和演化。如2013年6月发生在银行间市场的“钱荒”事件，即为流动性风险过度积聚的结果[5]。
[关键词] 肺癌；上皮间质转化；分子标志物；上皮-钙黏素；波形蛋白
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）07（b）-0041-04
[Abstract] Lung cancer has become one of the diseases with highest mortality throughout the world. Epithelial mesenchymal transformation （EMT） played an important role in the process of the invasion and metastasis of tumor， including the lung cancer. Researches focusing on the processes of EMT and its related markers in lung cancer helped seeking for accurate ways for molecular targeted therapy and to provide practical and feasible methods to make clinical diagnosis. In this paper， it summarized the phenomenon of EMT and EMT-related lung cancer markers to provide a new way for anti-tumor therapy.
[Key words] Lung cancer； EMT； Molecular markers； E-cadherin； Vimentin
肺癌已成为世界上发病率和死亡率增长最快的肺原发性恶性肿瘤[1]。在我国每年大约有40万人死于肺癌[2]。肺癌的转移是肺癌患者死亡及治疗失败的常见原因。绝大多数肺癌患者由于肺癌早期症状不明显及诊断方法敏感性不高，导致确诊时已处于肿瘤晚期而错过最佳的治疗时机[3]。大量研究已表明[4-6]，在肿瘤的侵袭和转移过程中上皮细胞向间质细胞的转化（epithelial-mesenchymal，EMT）扮演着十分重要的角色。EMT是肺癌发生侵袭转移的主要方式之一。在这个过程中，上皮细胞失去原来的特性，细胞间的黏附和连接逐渐减少，渐渐获得间质表型，运动性和侵袭能力有所增强，凋亡开始受抑，细胞形态开始发生间质样的改变等[7]。EMT发生的过程不仅是细胞形态的改变，还伴随着E-cadherin、Vimentin等相关分子标志物的改变。近年来，EMT在肺癌转移方面研究受到了广泛关注。因此阐明EMT在肺癌中的分子机制研究及标志物的研究进展有助于肺癌分子靶向治疗方式并为肺癌的临床诊断提供理论依据。
1 EMT概述
EMT这一概念早在1982年已由Greenberg提出，在体外培养鸡胚上皮细胞研究过程中发现晶体状体细胞出现上皮细胞转变为间质样细胞的现象[8]。EMT的发生过程是指细胞处于某些生理和病理的情况下，出现的一系列由上皮表型转变为间质表型的现象。在多种动物胚胎发育过程中EMT也发挥着重要作用，此种现象存在于胚胎早期发育过程以及外胚层和下腮弓间质融合的过程中，可导致鼻咽腔和口咽腔发生分离[9]。而通过对恶性肿瘤细胞株以及一些动物模型的研究表明[10]，EMT的现象同样存在于恶性肿瘤细胞侵袭周围组织和转移至远处器官的过程中。EMT使上皮源性肿瘤细胞失去相互间的连接，细胞形态发生改变，迁移能力得到增强，侵袭转移能力便由此获得。由此可见，原有细胞形态发生改变，向成纤维细胞等间质细胞样转变。
2 肺癌中的EMT现象及机制研究
肿瘤患者死亡的主要原因为肿瘤的复发及转移，90%恶性实体肿瘤的死因为远处转移[11]。已有研究证实[6]，在肺癌的侵袭和转移过程中也有EMT的发生，并且肿瘤的恶性程度由肿瘤细胞的EMT程度决定。恶性肿瘤中上皮间质转化现象的发生是引起肿瘤远处转移的关键步骤。在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织以及胸腔转移灶中螺旋-环-螺旋转录因子Twist会过度表达，其机制可能是通过分别下调和上调E-cadherin、Vimentin的表达，从而在NSCLC的发生与发展以及浸润转移的过程中发挥极大的作用[12]。而肺泡上皮细胞转化为间质细胞的过程可能是通过细胞形态学的一些改变和基质金属蛋白酶表达的增加，使癌细胞的侵袭性有一定增强，对肺癌的转移起到促进作用。抑制肺癌的转移可能可以通过阻断肺癌细胞的EMT过程及其信号转导途径来实现[13]。同时，也有研究表明[14]，在肺癌中存在EMT现象，并可引起多药的耐药，从而促进肿瘤的发生。
近年来，研究人员通过EMT标志物对肺癌发生机制进行了探索。转化生长因子β（TGF-β）具有调节细胞生长、凋亡、分化和迁移等多种功能。TGF-β1使肺癌细胞发生了上皮间质转化，细胞失去极性，上皮标志分子E-cadherin表达下降，而间质标志分子Vimentin和Snail表达上升[15]。E盒结合锌指蛋白ZEB1是EMT的关键转录因子之一，在肺癌EMT发生中起到重要作用，能与其辅助因子共同结合在E-cadherin启动子的E盒上，可抑制基因转录和E-cadherin 的表达[7]。TLE1已被证明是肺部的特异性致癌基因，以人的肺腺癌A549细胞作为模型，通过抑制E-cadherin蛋白的表达促进EMT的发生，对E-cadherin蛋白的抑制揭示了TLE1调节EMT的作用，探讨了TLE1致癌活性的机制研究[16]。
因此阐明肺癌EMT的分子机制有助于为肺癌治疗提供新的思路和靶点。
3 EMT分子标志物在肺癌研究中的进展
本文选取对肺癌EMT相关的分子标志物E-cadherin和Vimentin进行叙述。
3.1 上皮-钙黏素（E-cadherin）
E-cadherin是维持上皮细胞极性和上皮完整性不可缺少的细胞膜黏附蛋白，生理条件下E-cadherin蛋白具有调节细胞-细胞之间、细胞-基质之间的黏附，维持细胞组织结构完整性及稳定性的功能。E-cadherin蛋白若发生表达的下调则会使同种细胞之间黏附作用减弱或者失去，从而使得正常组织的发育成型不能完成；而当发生在恶性肿瘤细胞中时，细胞极性则会消失殆尽，进而使得细胞具备了侵袭性生长的特性。对E-cadherin的深入研究将对肺癌转移机制探索带来新突破。E-cadherin仅在上皮细胞中表达，而不在间叶细胞中表达[17]。
E-cadherin蛋白在肺癌中的表达具有一定的临床意义。孙菊杰等[18]对62例NSCLC患者肺癌组织和20例患者癌旁组织进行免疫组织化学检查，其中54.8%癌组织中E-cadherin蛋白表达增加，E-cadherin降低与肺癌临床分期和淋巴结转移有关，E-cadherin检测有助于评估肺癌恶性程度及预后。米丽丽等[19]采用免疫组织化学方法检测138例NSCLC肺组织发现，E-cadherin蛋白的低表达与肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及术后生存时间明显相关。彭海员等[20]通过流式细胞免疫法定量检测78例肺癌患者肺组织石蜡标本也发现，E-cadherin的低表达可能参与了肺癌的发生、发展以及转移的过程。
肺癌发生侵袭转移的一个重要原因就是EMT，药物靶向EMT这个过程或许是个有效的肺癌治疗策略。通过划痕实验和Transwell检测发现，采用我国传统中药人参皂苷Rg3，对肺癌细胞的迁移和侵袭能力具有抑制作用。人参皂苷Rg3通过增加E-cadherin可以明显的改变EMT标志蛋白，但是Snail、N-cadherin和Vimentin的表达下调了，同时还下调了肺癌中FUT4基因和蛋白的表达[21]。白雪峰等[22]采用免疫组化检测97例NSCLC术后病理标本中上皮性钙黏蛋白（E-cad）、β-连环素（β-cat）和神经性钙黏蛋白（N-cad）、纤连蛋白（Fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）等EMT相关标志物的表达情况，发现E-cad、β-cat表达发生了下调，而N-cad、FN、VIM表达升高，此结论证实了NSCLC中存在EMT现象，且与肿瘤侵袭转移相关，均可以作为 NSCLC恶性程度、转移复发、预后的判断指标。上述研究结果均表明E-cadherin可能参与了肺癌的发生、发展，检测E-cadherin或许可以作为肺癌治疗、预后的判断指标。
3.2 波形蛋白（Vimentin）
Vimentin是细胞骨架蛋白之一，特异性的分布于间质细胞中。波形蛋白是一种稳定表达于间叶细胞的中间微丝蛋白，通常在上皮组织不表达，癌细胞中一旦出现了波形蛋白的表达就预示着癌细胞从上皮表型向间叶表型发生了转变。经研究发现[23-24]，波形蛋白在NSCLC中的表达与癌细胞的分化程度低、侵袭性强和易转移密切相关，可作为评判肿瘤患者预后的一个指标。Vimentin蛋白表达与肿瘤细胞的侵袭和转移能力增加正相关[25]。
李世武等[26]采用Cochrane系统评价方法，Meta分析免疫组化检测NSCLC患者肿瘤组织波形蛋白表达水平发现，波形蛋白高表达不利于NSCLC患者总生存期和无病生存期预后。郭凯等[27]采用免疫组化法对72例鳞癌及腺癌患者肺组织进行检测发现，波形蛋白在癌组织中阳性表达率为59.72%，Vimentin蛋白随肺癌分化程度的降低，表达逐渐增高。Dauphin等[28]通过对164例鳞癌细胞，108例腺癌细胞及23例其他非小细胞肺癌组织进行免疫组化法检测，在145例肺癌组织中发现了Vimentin蛋白，且其表达显著高于神经内分泌大细胞，波形蛋白的高表达与肺癌的转移，分化程度密切相关。但也有研究表明[29]，上皮细胞可诱导出Vimentin蛋白的异常表达，在人类肺癌等许多上皮性肿瘤细胞尤其是低分化癌中确实存在Vimentin蛋白表达，且在上皮性肿瘤细胞中的异常表达与肿瘤局部浸润和转移的潜能密切相关。
4 讨论
随着对肺癌的不断深入研究，预防和治疗癌细胞转移已被公认为临床治疗癌症的关键。EMT通过增强癌细胞的流动性，浸润性和耐凋亡性刺激使得癌细胞具有转移的特性。确定EMT在肺癌的侵袭和转移的细胞及分子机制是研究重点。有研究表明，中药复方通过上调E-cadherin蛋白、下调Vimentin蛋白的表达从而阻碍肺癌组织EMT的发生，进而抑制肿瘤的增殖、侵袭、转移。因此药物作用于EMT途径是治疗肺癌的一个行之有效的方法。
综上所述，深入研究EMT在肿瘤侵袭转移中的作用及其调控机制，对于防治肺癌与开发抗肺癌药物具有重要意义，而寻找高敏感性与特异性的肿瘤标志物将对肺癌患者的肿瘤预防、早期诊断、预后判断发挥重要作用。
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一般资料 2007年12月～2010年8月在我院中西医结合科门诊就诊的300例肥胖型2型糖尿病患者,均符合1999年WHO糖尿病诊断标准,且BMI>25,中医辨证标准符合中华人民共和国卫生部制定的《中药新药临床研究指导原则》中脾气亏虚、痰瘀互阻证型。随机分为两组,治疗组200例,男56例,女144例;年龄36～73岁,平均61.15±9.7岁;糖尿病病程4.5～18年,平均11.69±6.49年。对照组100例,男27例,女73例;年龄38～74岁,平均60.88±10.18岁;糖尿病病程5.5～17.5年,平均11.35±5.35年。两组在性别、年龄、糖尿病病程及中医辨证分型方面差异无统计学意义(P>0.05)。
排除标准 酮症或酮症酸中毒者,并发大血管事件者(心脑血管疾病和周围动脉阻塞性病变),并发微血管病变者(糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变),并发感染者,肝肾功能不良者,甲状腺功能低下者。
治疗方法 两组均给予糖尿病饮食,注射胰岛素治疗,同时对症支持治疗。治疗组在上述治疗基础上加用马来酸罗格列酮(商品名:文迪雅,国药准字H20020475,葛兰素史克中国有限公司生产)4 mg/次,1次/日,口服;脂必泰胶囊1粒/次,2次/日,饭后温开水送服。两组均以18周为1个疗程,随访>1年。
观察指标 治疗前及治疗1个疗程后检测两组全血黏度100/s(mPa・s)、血浆黏度100/s(mPa・s)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、尿白蛋白排出率(UAER)、血清胰岛素样生长因子-2(IGF-2)并计算胰岛素敏感指数(ISI)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),同时检测血压、心电图、Holter心电图、心肌酶、肾功能。其中,血液流变学均采用酶法测定,UAER以酶联免疫法测定,IGF-2采用放射免疫法测定,ISI=1/(FINS×FBG),HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。治疗1年后统计终点事件的发生例数(%)及住院次数。
药物不良反应观察 随时记录胃肠道不适、恶心、呕吐、肌痛等药物不良反应,并检测肝功能全项及血、尿常规。
统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,计数资料采用X2检验,计量资料采用t检验,平均值以X±S表示。
结果
两组治疗前后血液流变学和血压的比较见表1。
两组治疗前后糖化血红蛋白、尿白蛋白排出率、血清胰岛素样生长因子-2、胰岛素敏感指数及胰岛素抵抗指数的比较见表2。
两组治疗1年后终点事件发生例数及年住院次数比较见表3。
不良反应:两组治疗1疗程前后患者血、尿常规均无显著变化,治疗组3例出现血清谷丙转氨酶轻度升高,1例因出现胃痛退出。
讨论
马来酸罗格列酮片(文迪雅)属噻唑烷二酮类口服抗糖尿病药,为高选择性过氧化物酶体增殖激活受体γ激动剂,通过提高胰岛素敏感性而控制血糖水平,用于治疗2型糖尿病。
糖尿病患者日久常伴脂质代谢紊乱和高黏血症。脂必泰中的红曲、山楂、泽泻、白术4种药物具有功效为健脾消食、除湿祛痰、活血化瘀,十分切中脾虚为本、痰瘀为标、久病入络、变证从络的胰岛素抵抗糖脂代谢紊乱的发病机理。
关键词：化疗药物；肺癌细胞；Livin基因
随着吸烟人群的增加（包括吸入二手烟）及大气污染的加重，肺恶性肿瘤的发病率逐年增加；治疗目前除手术切除外，主要为化疗与放疗，但化疗药物的耐受性往往影响化疗药物的疗效；目前研究发现Livin基因与肿瘤的耐受性有一定的关系[1，2]，因此，我们选用常见的化疗药物作用于肺癌细胞株，观察Livin基因表达的改变，探讨Livin基因与细胞凋亡的相互关系。
1资料与方法
1.1一般资料 江苏省无锡市人民医院肿瘤科提供化疗药物依托铂苷、卡铂、多柔比星。中科院上海生化与细胞生物学研究所提供人肺癌细胞株（A549）。
1.2实验用仪器与试剂 96孔细胞培养板（Costar， Denmark）；细胞培养箱（NAPCO，USA）；倒置相差显微镜（OLYMPUS，JAPAN）。DMEM培养基（GIBCO，USA）（每L含10%小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg，青霉素100U、链霉素100U、pH7.4）；胰蛋白酶（MERCK，USA）；二甲基亚砜（DMSO）（Merck，Germany），无水乙醇（分析纯，上海振兴化学试剂厂，批号：20021200365）；Livin（abcam USA）、碘化丙啶（PI） （Sigma，USA），南京生物工程公司提供引物。
1.3 方法
1.3.1体外培养实验用细胞株 用含10%小牛血清的DMEM培养液培养、传代人肺癌细胞株（A549）。
1.3.2 实验分组 正常对照组；依托铂苷、卡铂、多柔比星浓度按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78ug/ml，与A549共同培养，分别作用24、48、72h。
1.3.3 MTT法检测化疗药物对细胞活力的影响 使用0.25%胰酶消化培养至第3代的各组A549细胞后，吹制成单个细胞悬液（细胞密度为1.0×104），分别接种到96孔板中（不含细胞的血清（为消除血清物质对光吸收值的影响）（1～2列）、空白组细胞悬液（3～4列）；模型组细胞悬液（5～6列）；不同浓度的测试药物组细胞悬液（7～12列）），于37℃、5%二氧化碳的培养箱放置并作用24h、48h、72h后，每孔再加入MTT溶液20ul，继续孵育4h后终止培养。小心吸弃上清液，小孔加入DMSO 200μl溶解结晶物并振荡10min后在酶标仪上测定各孔的吸光值。
1.3.4 RT-PCR 检测Livin mRNA的表达 根据美国NCBI 的Genbank 提供的Livin 和β-actin mRNA 序列， 设计引物序列如下： ①LivinSense： 5′-TGAGGAGTTGCGTCTGGC-3′；Antisense： 5′-GGCTGCGTCTTCCGGTTC-3′。②β-actin（BC004251） Sense： 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′； Antisense： 5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。PCR应体系均为15ul，其中含cDNA模板2.5ul，SYBR Green 7.5ul，引物 0.6ul，去离子水4.4ul，95℃预变性5min，94 ℃45sec，56℃45sec，72 ℃50sec，35个循环；比较Ct法（Ct法）分析结果。
1.3.5蛋白印迹（Western blots） 分析 常规细胞蛋白质的提取、定量， SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。湿转法转膜后先后与5%BSA、一抗（浓度1∶1 000）、过氧化物酶偶联的二抗（浓度1∶10 000） 孵育， 运用ECF化学发光显影、荧光图像扫描仪扫描存入电脑。
1.4数据分析 运用SPSS13.5统计软件，以均数±标准差表示，采用单因素方差分析及t检验。
2结果
2.1对A549细胞凋亡的改变 实验结果提示，A549细胞经化疗药物作用后，细胞的抑制明显增高（P
2.2各化疗药物组细胞Livin mRNA的表达 RT-PCR结果显示，化疗药物多柔比星、卡铂与A549细胞分别作用24h、48h后，Livin 基因表达量呈逐渐下降趋势， 且浓度越高， 时间越长， 则表达量越少；72h后 Livin基因的表达量有增高趋势；而依托铂苷分别作用24、48、72h后， Livin 基因的表达量均呈逐渐下降趋势， 且其幅度随药物浓度的增加而增加（图4）。
2.3各化疗药物对A549细胞的Livin蛋白的影响 化疗药物采用IC50 的抑制浓度， 分别作用于A549细胞 24h、48h、72 h。化疗药物多柔比星、卡铂作用细胞24h、48h，Livin 蛋白表达量呈逐渐下降；72h Livin蛋白表达量有增高趋势；依托铂苷作用72 h 后， Livin 蛋白的表达均逐渐下降， 且其幅度随药物浓度的增加而增加（图5）。
3讨论
肺癌目前是全世界肿瘤死亡原因的第一位。近年来，认识到大多数化疗药物是通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖而实现治疗作用。Livin 基因位于染色体20q13.3， 全长46 kb， 包含7 个外显子和6 个内含子，它有两种异构体：Livinα 和Livinβ。Livin 基因在胎盘和发育中的组织以及黑色素瘤、白血病、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等一些肿瘤组织异性高表达， 而在大多数正常组织中不表达或仅有少量表达[3，4]，并且有研究认为，癌症患者放化疗的耐药与Livin基因的表达水平有关[5]。Livin基因可以通过抗死亡受体途径、抗线粒体途径和激活JNK1 信号转导等途径发挥抑制细胞凋亡和抵抗肿瘤放化疗作用[6]。
实验结果显示，A549经化疗药物多柔比星、卡铂作用后，Livin基因表达初期呈降低， 但随化疗药物作用时间的增加，Livin基因表达呈明显上升；Livin基因早期不仅通过与procaspase-9直接结合抑制其活性，还可以通过抑制caspase-3 的活性， 阻断其对procaspase-9 的正反馈激活，从而介导细胞凋亡通路；此外后期Livin基因作为一种酶抑制剂，通过BIR -结构域结合凋亡过程中激活的核心物质Caspases蛋白（如Caspase-3、Caspase-7 等）介导Caspases蛋白的失活和降解而发挥抗凋亡的作用；Livin基因表达规律与MTT检测的细胞活力结果一致。依托铂苷与Livin基因表达呈量效关系，作用效果优于多柔比星及卡铂，在临床上可以减少肿瘤细胞的耐受性。
综合上述，对于非小细胞肺癌，Livin基因可能通过调节肿瘤细胞的凋亡影响肿瘤的转归， 并可能为肺癌诊断和治疗提供新的方向。
参考文献：
[1]Gazzaniga P， Gradilone A， Giuliani L， et al. Expression and prognostic significance of LIVIN， SURVIVIN and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer[J].Ann Oncol， 2003， 14（ 1） ：85- 90.
[2]Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al.Detection of anti-Livin antibody in gastrointestinal cancer patients[J] .Clin Chem， 2003，49 （ 7） ： 1206-1208.
[3]Vucic D， Stennicke H R， Pisabarro M T， et al. ML-IAP，a novelinhibitor of apotosis that a preferentially expressed in humanmelanamas [J]. Curr Biol，2000，10（21）：1359-1366..
[4]Choi J， Hwang Y K， Sung K W， et al. Expression of Livin， an antiapoptotic protein， is an independent favorable prognostic factor in child acute lymphoblastic leukemia [J].Blood，2007，109 （2）：471-477.
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